王俊峰，關(guān)雪峰，楊永菊

( 1,遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽 110847; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽 110032)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的骨關(guān)節(jié)慢性退行性病變，發(fā)病率約占我國人口的18%[1]。目前對于OA的治療，尚無有效的治療方案，而中醫(yī)藥對于OA的治療有著廣闊的前景，OA的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子、氧化應(yīng)激、細胞凋亡自噬等有著密切聯(lián)系，且其中多為信號通路介導(dǎo)。本文就細胞信號通路的抑制和促進兩個方面，分別探討中醫(yī)單體、復(fù)方、針灸、手法等療法對OA信號通路的影響,以期對日后的研究提供相應(yīng)的參考。

1 骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與治療機制

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為OA的特征性改變是軟骨的降解，當人體關(guān)節(jié)發(fā)生退變后，會引起關(guān)節(jié)軟骨細胞的基質(zhì)組成和代謝水平發(fā)生相應(yīng)變化，這些變化可以引起細胞因子的釋放，釋放的細胞因子會激活相關(guān)細胞通路從而加重骨關(guān)節(jié)的破壞，發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。目前較為推崇OA的治療機制為中醫(yī)藥通過改善OA局部微循環(huán)，降低局部炎癥因子濃度，改善關(guān)節(jié)軟骨和滑膜細胞的新陳代謝，抗氧化及細胞凋亡等，從而減弱和延緩細胞通路相關(guān)蛋白的表達，促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，達到治療骨關(guān)節(jié)炎的效果[2]。

2 中醫(yī)藥對于OA抑制信號通路的研究

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

Velasco等[3]發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路對關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的形成及分化具有雙向調(diào)節(jié)作用, 既可以促進軟骨的發(fā)生和發(fā)展, 又可以促進軟骨的退變與凋亡。Wnt信號傳導(dǎo)途徑與4個細胞內(nèi)途徑有關(guān)，其中經(jīng)典信號途徑最為重要，也是目前研究較多的信號通路，其可概括為以下途徑:Wnt與受體蛋白結(jié)合→Frz→Dsh→β-catenin的降解復(fù)合體解散→β-catenin積累→細胞核→TCF/LEF→基因轉(zhuǎn)錄如c-myc、cyclinD1y。除上述信號通路傳導(dǎo)外，Wnt/β-catenin信號通路還包含重要的負向調(diào)節(jié)因子抑制其進程，最常見的為抑制因子DKK1，硬化蛋白和分泌型Fz相關(guān)蛋白。目前中醫(yī)藥對于Wnt/β-catenin信號通路的研究，補腎活血類中藥及復(fù)方研究較多，且靶點多集中在Wnt和β-catenin蛋白檢測。

中藥丹參具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛之功效，其主要成分為丹參酮ⅡA，宋奕等[4]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可以通過下調(diào)β-catenin信號通路中β-catenin蛋白的表達，從而達到治療骨關(guān)節(jié)炎的效果，猜測這與丹參酮ⅡA可以抑制β-catenin信號通路表達，延緩軟骨細胞的退變，促進軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原蛋白的合成有關(guān)。黃芪甲苷為中藥黃芪的主要組成成分，MMP-7是軟骨基質(zhì)降解的重要因素，而COMP、CTX-Ⅱ是軟骨基質(zhì)分解的產(chǎn)物，實驗證實黃芪甲苷可明顯降低滑膜軟骨中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ蛋白的表達[5]，這與黃芪甲苷抑制Wnt/β-catenin信號通路改善改善滑膜-軟骨微環(huán)境，促使軟骨細胞功能恢復(fù)有關(guān)。研究學(xué)者利用Westernblot方法檢測蛋白表達，證實了姜黃素可通過抑制Wnt2、GSK-3β、β-catenin的表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路，達到促進軟骨細胞增殖的目的[6]。

WIF1是一種能夠抑制Wnt信號通路的胞外蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典方劑右歸丸可以通過提高WIF1蛋白的合成及降低其下游基質(zhì)金屬蛋白酶和IL-6的表達，達到抑制Wnt信號通路，促進細胞凋亡的作用[7]。鄺高艷等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)加味獨活寄生湯可以抑制1L-β炎癥因子的表達，進而降低Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin mRNA的表達，猜測其可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡、細胞自噬等有關(guān)。在探究中醫(yī)藥對于Wnt/β-catenin信號通路作用中，趙婧等[9]研究發(fā)現(xiàn)祛痰化瘀利濕方可以抑制GSK-3β蛋白，下調(diào)β-catenin、CyclinD1、MMP-7蛋白的表達，提示祛痰化瘀利濕方可以抑制β-catenin核移位，降低靶基靶基因蛋白的表達，改善軟骨損傷。

2.2 NF-κB信號通路

NF-κB信號通路參與介導(dǎo)軟骨細胞的增殖、分化、炎癥，凋亡等多種過程，在OA的發(fā)生、發(fā)展、變化過程中起著重要的作用[10]。有研究證實當細胞受到促炎因子或病原體相關(guān)分子刺激后，會促使IKK的合成，同時使ⅠκB蛋白磷酸化，之后ⅠκB再發(fā)生泛素化，引起ⅠκB水解，釋放NF-κB，進一步調(diào)節(jié)NF-κB相關(guān)基因表達。目前對于NF-κB信號通路的研究多集中在炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，公認的機制為相關(guān)誘因誘導(dǎo)NF-κB通路激活，引起炎性因子釋放加重軟骨退變，從而誘發(fā)OA。

中藥龍膽具有“活血舒筋、祛風除濕”的功效，常與其他藥物配伍治療關(guān)節(jié)疼痛。黃力鵬等[11]將30只雄性SD大鼠隨機分為模型組、治療組和對照組，研究發(fā)現(xiàn)較比于其他兩組，治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中NO、TNF-α及NF-κB蛋白含量明顯減低，而I-κB蛋白表達明顯增高。提示龍膽苦苷可以抑制炎癥因子，促進I-κB合成，進而誘導(dǎo)I-κB與NF-κB結(jié)合形成非活性的二聚體，抑制了NF-κB在細胞之間的穿梭，起到抑制NF-κB信號通路，改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀的作用。中藥枸杞具有補肝腎，強筋骨的功效，其主要成分為枸杞多糖，實驗研究發(fā)現(xiàn)[12]，枸杞多糖能夠有效降低關(guān)節(jié)軟骨細胞中IL-1β、TNF-α、iNOS炎性細胞因子及NF-κBp65蛋白水平，提示枸杞多糖可以下調(diào)趨化因子和促炎介質(zhì)水平，抗氧化損傷，抑制NF-κB信號通路，改善骨關(guān)節(jié)炎癥損傷。研究發(fā)現(xiàn)白芍中的有效成分白芍總苷可以促進人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖，同時促進NF-κB通路中Bcl-2表達，降低Bax、Caspase-3、MMP-13 /TIMP-1的表達水平，抑制IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞TNF-α、IL-6和IL-8的分泌[13]。朱海泉等[14]研究發(fā)現(xiàn)川芎中分離出的川芎嗪可以抑制Ⅱ型膠原合成、增強MMP-13的表達，降低NO、TNF-α和IL-6水平，提示這與減弱NF-κBP65磷酸化水平有關(guān)。

《金匱要略》中治療寒濕痹癥型OA的烏頭湯對NF-κB信號通路中的NF-κBp65蛋白表達有明顯的抑制作用，提示這可能與烏頭湯抑制一氧化氮合酶、IL-1β、IL-6、IL-18、和TNF-α炎癥因子的的釋放，改善軟骨細胞炎性狀態(tài)有關(guān)[15]。許麗梅等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)獨活寄生湯可通過抑制IL-1β、TNF-α及MMPs的生成，抑制NF-κB蛋白核轉(zhuǎn)位, 減輕脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥反應(yīng)，延緩軟骨退變。ACT1是NF-κB信號通路活化蛋白，萬磊等[17]發(fā)現(xiàn)補腎活血類中藥湯劑消瘀接骨散對NF-κB銜接蛋白激活劑1及ACT1具有明確的抑制作用，猜測消瘀接骨散可能通過抑制IL-1、IL-17表達，抑制ACT1激活NF-κB過程，改善骨關(guān)節(jié)炎血瘀狀態(tài)。周葉等[18]研究證實獨活寄生湯和身痛逐瘀湯化裁而來的骨痹活血湯可通過SphK1-S1P信號軸抑制NF-κB信號通路的激活，降低SphK1、S1P、NF-κB，MMP-3因子水平的表達。

2.3 TGF-β信號通路

TGF-β受體有3種形式分別為TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，當TGF-β信號分子先與Ⅱ型受體結(jié)合活化，之后再磷酸化Ⅰ型受體，最后通過smad蛋白向細胞核內(nèi)傳遞信息，改變細胞行為。TGF-β信號通路中與骨關(guān)節(jié)軟骨有關(guān)的信號通路包含兩個，分別為ALK5經(jīng)smad2、3傳導(dǎo)引起的TGF-β信號通路和ALK1經(jīng)smad1、5、8介導(dǎo)的BMP信號通路，TGF-β通路可以抑制軟骨細胞的分化，而BMP通路的可以促進軟骨細胞的分化[19]。這兩種信號通路的介導(dǎo)都與Ⅹ型膠原(COL-X)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13等多種因子參與有關(guān)。目前對于TGF-β信號通路的研究大多是中藥復(fù)方研究，且效應(yīng)因子多集中在TGF-β1和IL-1。

中藥鹿茸具有壯腎陽，益精血，強筋骨的功效，Smad6、7為TGF-β信號通路的抑制因子，Smad蛋白1、2、3、5、8、9為膜受體激活劑，盧賀等[20]將健康雌性SD大鼠50只隨機分為5組，結(jié)果顯示鹿茸灌胃組血清Smad2、3的表達量明顯升高，而Smad6、7的表達量明顯降低。這提示鹿茸可以通過激活Smad2、3，抑制Smad6、7信號傳導(dǎo)，達到促進關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)的作用。也有研究表明[21]，丹參酮ⅡA能夠促進BMP-2生成，達到誘導(dǎo)間充質(zhì)前體細胞向成骨細胞分化的作用。

楊帆等[22]研究發(fā)現(xiàn)補腎活血方可以通過調(diào)節(jié)TGF-β1、BMP-4和BMP-7的分泌，以此來保護受損的軟骨細胞，緩解病情的進展。研究證實益氣活血的中藥湯劑消骨痛湯能通過調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中TGF-β1和BMP2的表達水平，以此來刺激軟骨蛋白多糖的合成，達到促進軟骨細胞的修復(fù)和再生，維持關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)環(huán)境平衡的作用[23]。

在研究火針對于膝關(guān)節(jié)退行性病變的機制中發(fā)現(xiàn)[24]，火針治療可有效改善大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷狀態(tài)，降低血清及膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 MMP-3、TGF-β1和TNF-α因子的表達。同樣，電針刺激患者“梁丘”、“內(nèi)膝眼”、“血?！薄ⅰ盃俦恰?、“阿是穴”等穴位和普通針刺大鼠后肢膝關(guān)節(jié)“膝前”、“后三里”和“陽陵泉”也可以明顯抑制KOA血清中TGF-β1的表達[25,26]，這都與其可以改善能夠改善局部組織水腫、滲出及加快局部組織微循環(huán)，改善炎性狀態(tài)，促進軟骨細胞修復(fù)有關(guān)。

2.4 PERK / Bip信號通路

冷刺激、機械損傷等應(yīng)激刺激均會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路，引起細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與3種蛋白的調(diào)控有關(guān)，分別為PERK、IRE1、ATF6。研究發(fā)現(xiàn)，活化后的PERK、IRE1及ATF6蛋白會通過增強Caspase-12的轉(zhuǎn)錄活性引起細胞凋亡[27]。其中PERK /Bip是啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡重要信號傳導(dǎo)途徑。在探求中醫(yī)藥對大鼠的軟骨退變的實驗中，對于PERK / Bip信號通路研究較多為中藥方劑獨活寄生湯。

葉錦霞等[28]將培養(yǎng)第三代的軟骨細胞分為空白組、模型組、實驗高、中、低劑量組。以AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，實驗發(fā)現(xiàn)實驗組ATF4、BIP、Caspase-3、Caspase-12的含量均低于其他兩組。提示透骨消痛膠囊可以抑制TG的軸向作用，使Caspase-12和Caspase-3活性減低，抑制PERK信號通路引起的細胞凋亡過程。趙林燦等[29]采用寒冷刺激法建立膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，研究發(fā)現(xiàn)獨活寄生湯可明顯下調(diào)TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達，并使軟骨細胞中的PEAK、Bip、Caspase-9的mRNA的表達也明顯下降，這與獨活寄生湯通過抑制炎癥因子下調(diào)PEAK/Bip信號通路，改善軟骨細胞凋亡狀態(tài)有關(guān)。陳俊等[30]研究發(fā)現(xiàn)獨活寄生湯還可抑制PEAK因子的下游eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3的蛋白表達，猜測這與獨活寄生湯可抑制PERK / Bip信號通路的表達有關(guān)。

2.5 Toll樣受體信號通路

Toll樣受體是一種模式識別受體，與炎癥的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，現(xiàn)代研究認為Toll樣受體引起的固有免疫應(yīng)答是促使OA發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。目前已知的Toll樣受體家族有成員有13個，而TLR1至TLR10均在人類均有表達，當Toll樣受體與銜接蛋白銜接后會激活MyD88依賴性與MyD88非依賴性兩條通路[31]，其中TLR2、TLR4是與OA最為密切的信號傳導(dǎo)途徑。目前探究骨關(guān)節(jié)炎Toll樣受體信號通路機制中，中醫(yī)藥對于MyD88依賴性信號通路研究較多。

青藤堿是青風藤的主要成分，研究表明青藤堿中、高劑量組TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表達較空白組和低劑量組均具有明顯下調(diào)，猜測其可能通過抑制固有免疫，達到下調(diào)TLR/MyD88信號通路表達的作用[32]?！秱摗分薪?jīng)典藥對桂枝芍藥具有溫經(jīng)通脈、柔筋之痛之功效，研究發(fā)現(xiàn)桂枝和芍藥可不同程度的抑制關(guān)節(jié)軟骨表面TLR2、TLR4的陽性表達和細胞上清中IL-1β、MMP-13的分泌，其可能是通過抑制炎癥因子，下調(diào)Toll樣受體信號途徑，抑制機體固有免疫[33]。

在對于膝骨關(guān)節(jié)炎組織形態(tài)學(xué)和固有免疫的研究中，發(fā)現(xiàn)通絡(luò)止痛方也可明顯抑制TLR4、NF-κB、MyD88蛋白的表達，進而抑制滑膜細胞增生及炎癥反應(yīng)，減緩軟骨退變[34]。有研究學(xué)者提出NF-κB可能是TLR4引起下游細胞因子分泌的樞紐，陳俊等[35]發(fā)現(xiàn)烏頭湯不僅可以作用NF-κB p65信號靶點，也可以降低TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達，達到抑制膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥的作用，其機制可能是烏頭湯通過下調(diào)TLR4信號通路，抑制NF-κB的表達，進而改善滑膜功能。研究發(fā)現(xiàn)[36]，火針針刺內(nèi)外膝眼、足三里聯(lián)合玻璃酸鈉，可降低治療組外周血TLR4濃度，達到保護關(guān)節(jié)軟骨的效果。推拿手法對TLR4信號通路也有抑制作用，在給予大鼠膝關(guān)節(jié)的內(nèi)膝眼、外膝眼、血海、梁丘等穴行一指禪推法后，推拿可以降低膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織TLR4、MyD88 mRNA的表達水平，從而抑制炎癥反應(yīng)[37]。經(jīng)筋微創(chuàng)松解術(shù)也可抑制TLR4、MyD88的表達，改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛、活動障礙等癥狀[38]。

2.6 MAPK信號通路

MAPK信號通路的激活與細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷最為重要的信號通路。MAPK信號通路遵循三級激酶級聯(lián)反應(yīng)進行，即為磷酸化的MAP3K可激活MAPKK，磷酸化的MAPKK再激活MAPK，并使其磷酸化。MAPK信號通路主要包括ERK1/2通路、JNK通路、P38通路和ERK5通路等多條信號通路[39]。其中研究較多的為ERK1/2和P38信號通路。

研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷可以抑制細胞中增殖相關(guān)基因Ki67和PCNA mRNA表達水平，并降低p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表達[40]。李曉東[41]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠上調(diào)軟骨細胞的自噬水平，抑制IL-10誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，其作用機制與ERK1/2信號通路介導(dǎo)有關(guān)。

許駿等[42]探究補腎益肝活血方含藥血清對骨關(guān)節(jié)炎模型鼠ERK/p38MAPK信號通路的影響，通過對SD大鼠灌藥5 d制取含藥血清，細胞傳代培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)補腎益肝活血方可以明顯降低IL-1β、TNF-α、ERK、p38MAPK的表達。這與補腎益肝活血方通過降低IL-1β和TNF-α炎癥因子的表達，進而抑制細胞內(nèi)的ERK1/2和p38MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)電針可通過調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、C-MYC、C-FOS、C-JUN蛋白的表達，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變[43]。相應(yīng)手法刺激也可以抑制ERK1/2信號通路的傳導(dǎo)。在給予家兔髕骨按揉、關(guān)節(jié)被動屈伸等形式的手法治療8周后，發(fā)現(xiàn)手法組軟骨P38、ERK1/2及滑膜組織 IL-1β、iNOS、MMP-13的mRNA表達水平較模型組有明顯的降低[44]。

3 激活信號通路的研究

3.1 PI3K/Akt信號通路

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在軟骨細胞凋亡過程中扮演者重要的角色。受體酪氨酸激酶的活化能夠?qū)I3K激活，進而使AKT發(fā)生磷酸化，使其能夠作用于TSC1/SC2發(fā)生解聚，解聚后的TSC1/TSC2最終激活mTOR及下游轉(zhuǎn)錄因子從而激活細胞凋亡相關(guān)基因的表達[45]。目前中醫(yī)藥對于PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療研究多集中在炎癥因子IL-1β、TNF-α和軸蛋白PI3K、Akt。

實驗發(fā)現(xiàn)當歸牛膝注射液可以抑制軟骨細胞凋亡，當歸牛膝組AKT的Thr308表位活化程度與正常組相同，證明了當歸牛膝可以激活PI3K/Akt信號通路，抑制軟骨細胞凋亡[46]。川芎提取物川芎嗪聯(lián)合塞來昔布可改善早期膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血液高凝狀態(tài)，降低軟骨組織IL-6、IL-1β炎性因子水平，進一步上調(diào)軟骨組織中p-PI3K和p-Akt蛋白含量，改善關(guān)節(jié)軟骨病變[47]。

在實驗研究中發(fā)現(xiàn)消腫止痛合劑可以明顯下調(diào)TNF-α、IL-1β炎癥因子的表達，并且同時使PI3K、AKT、Caspase-3 基因及蛋白表也顯著降低，這與消腫止痛可減輕炎癥因子的表達，減緩PI3K/Akt信號通路的細胞凋亡過程，從而達到保護關(guān)節(jié)軟骨，延緩OA 病情進展的作用有關(guān)[48]。

張媛媛等[49]研究電針對于模型大鼠軟骨細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)電針刺激可以提高Bcl-2表達，降低Bax表達，減少炎癥因子IL-1β、TNF-α 生成，且這與電針刺激時間長短有著密切聯(lián)系。

4 展望

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展變化與炎癥因子，氧化應(yīng)激、細胞凋亡，細胞自噬等都有著密切的聯(lián)系，且多與信號通路參與有關(guān)。正如本文中所提到的對于骨關(guān)節(jié)炎信號通路研究可分為抑制信號通路和激活信號通路兩方面，然而對于激活信號通路的研究并沒有大量實驗為其佐證，這也為日后的研究提供了相應(yīng)的參考。因中醫(yī)藥治療的副作用小，臨床療效確定等優(yōu)勢性，使得近年來對于中醫(yī)藥對于骨關(guān)節(jié)炎信號通路作用機制探究也越來越多，雖然研究較多，但仍存在諸多問題有待考究，如目前對于骨關(guān)節(jié)炎的研究較多集中在Wnt/β-catenin和NF-κB信號通路和個別靶蛋白的研究上，然而對于PERK/Bip和Toll樣受體信號通路及軸蛋白的研究仍然較少；在探究骨關(guān)節(jié)炎信號通路的作用機制中，中藥復(fù)方研究仍占絕大多數(shù)，中藥復(fù)方成分復(fù)雜性，仍是其缺乏有力的證據(jù)證明中醫(yī)藥對于骨關(guān)節(jié)炎的具體作用機制的問題所在。望今后研究學(xué)者多從中藥單體藥理學(xué)研究及信號通路的上下游蛋白著手，較多的開展信號通路的拮抗和協(xié)同作用研究，探討較為確切的中醫(yī)藥治療OA的作用機制。