馬忠平 楊云 張志峰 葉楠 楊毅峰

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030

骨質(zhì)疏松被定義為以骨骼強度降低、骨折風險增加為特征的一類骨骼疾病。骨質(zhì)疏松通常伴有輕微癥狀或無癥狀，是臨床病理性骨折的常見原因，也是影響人類健康的高危因素之一[1]。相關(guān)研究報道，世界范圍內(nèi)骨質(zhì)疏松的發(fā)病率在超過50歲人群中為15%，在80歲以上的人群中為70%[2-3]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病率具有性別特異性：與男性相比，女性的發(fā)病率更高[4]，2%～8%的男性和9%～38%的女性受到來自骨質(zhì)疏松的不同程度的影響[5]。研究指出，美國近1 000萬人患有骨質(zhì)疏松，超過1 800萬人骨量低[6]。而據(jù)國際骨質(zhì)疏松基金會預測，至2050年將有超過50%的骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生在東亞和東南亞[7]。且由于絕經(jīng)后雌激素水平降低對骨量的影響，老年婦女中骨質(zhì)疏松的發(fā)病率將快速且持續(xù)上升[8]。

骨髓是人體的主要造血器官，由骨髓造血干細胞、骨髓脂肪組織和基質(zhì)細胞組成[9]。成骨細胞由骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化而來，在骨形成中具有重要作用。研究指出，與正常人相比，骨質(zhì)疏松患者成骨分化低于正常，由此可知成骨細胞分化水平與骨質(zhì)疏松病理過程的發(fā)生、發(fā)展與演變密切相關(guān)[10]。Wnt/β-catenin是常見信號轉(zhuǎn)導通路，參與控制條件多種生物現(xiàn)象[11-12]。成骨細胞分化已被證實受Wnt/β-catenin途徑的調(diào)節(jié)[13-15]。研究指出，成骨細胞的分化過程中同時受到一系列蛋白調(diào)節(jié)，如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體(osterix，OSX)、SRY-box 9(SOX9)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(recombinant runt related transcription factor 2，RUNX2)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)[12]。目前未見研究報道并探討成骨細胞分化過程中Wnt/β-catenin信號通路與相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的相互關(guān)系。

芝麻油常用于膳食中的營養(yǎng)補充[16-17]。芝麻素是一種從花椒植物中分離而來的木脂素，是芝麻油中的一種常見成分(約含0.25%)。天然芝麻素為右旋體，芝麻素亦可人工化學合成。Orawan等[18]證實芝麻素可以通過激活p38-ERK(extracellular signal-regulated kinases)/MAPK(mitogen-activated protein kinase)細胞信號傳導通路來促進人類胎兒成骨細胞增殖以及人類脂肪來源干細胞的成骨分化。由此可知，芝麻素與成骨細胞分化密切相關(guān)，在骨質(zhì)疏松的預防和治療中可能發(fā)揮重要作用，然而，芝麻油作用于BMSCs進而影響骨形成的具體機制尚不十分清楚，其對骨質(zhì)疏松的作用影響也鮮有研究。

本研究應用芝麻素干預大鼠股骨分離的BMSCs，在沉默Wnt/β-catenin或不沉默Wnt/β-catenin的情況下檢測BMSCs的成骨分化，進而分析芝麻素對骨質(zhì)疏松的作用。

1 材料和方法

1.1 芝麻素制備

芝麻素(S9314；Sigma-Aldrich LLC.，USA)使用二甲基亞砜(DMSO；Sigma)溶解為14.22 mmol/L的溶液，并儲存于-20℃。

1.2 Wnt/β-catenin信號通路阻斷劑制備

FH535(Sigma)溶解于濃度為10 mmol/L的二甲基亞砜(sigma)中，保存在-2℃。

1.3 細胞培養(yǎng)

SD大鼠(4周齡)購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心。所有動物實驗均按照“實驗動物護理原則指南”(NIP出版物85-23，1996年修訂)進行，并經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(項目編號為2017032，日期為2017年7月15日)。

由大鼠股骨分離BMSCs，將大鼠股骨與周圍軟組織分離并取出。使用a-Minimum Essential培養(yǎng)基(a-MEM；Thermo Fisher Scientific，Ltd，上海，中國)洗滌骨髓。將骨髓切片，用含有10%胎牛血清(FBS；Thermo)、100 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素(Sigma)的α-MEM培養(yǎng)。去除未貼壁的細胞，貼壁的BMSCs用于培養(yǎng)和擴增以及進一步的實驗。當細胞培養(yǎng)匯合率接近90%時，貼壁的BMSCs傳代。之后將2～4代BMSCs用于研究實驗。

1.4 骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化

BMSCs種植于6孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度為1×104個/孔(康寧公司，上海，中國)。經(jīng)含10%胎牛血清、50 μmol/L抗壞血酸(Sigma)、0.1 μmol/L DMSO和10 mmol/Lb-甘油磷酸酯(Sigma)的α-MEM誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化7 d。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖/毒性以及ALP表達

BMSCs種植于96細胞培養(yǎng)板，細胞密度為3×103細胞/孔。24 h后，用芝麻素(0、1或10 μmol/L)處理骨髓間充質(zhì)干細胞3 d，以0.1%二甲基亞砜作為陰性對照(NC)。使用Caspase-8比色分析試劑盒(Abcam PLC.，上海，中國)進行細胞毒性測定。在450 nm處測量光密度(OD)值。

BMSCs由NBT-BCIP?溶液(Sigma)染色，用于檢測成骨細胞BMSCs中的堿性磷酸酶(ALP)。

1.6 免疫組織化檢測Osterix(OSX)表達

BMSCs成骨分化后，以1×105細胞/孔的密度接種于帶蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中。24 h后，應用芝麻素(0 μmol/L、1 μmol/L或10 μmol/L)處理細胞3 d。之后細胞經(jīng)4%多聚甲醛(碧云天生物科技有限公司，上海，中國)在25 ℃下固定30 min。用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)(碧云天)洗滌細胞， 25 ℃下振蕩10 min，之后使用3%的H2O2/甲醇(博士德生物技術(shù)有限公司，武漢，中國)于25 ℃下孵育20 min，后使用山羊血清(索萊寶科技有限公司，北京，中國)在25℃下阻斷30 min。然后與兔抗SP7/osterix(OSX)抗體(1∶100)(ab22552，abcam)在4 ℃的濕盒中孵育過夜。使用預冷的PBS洗滌細胞，后與山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1∶100)(7071，Cell Signal Technology，Inc.，上海，中國)于25 ℃孵育30 min。經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(ZSGB-BIO，北京，中國)和蘇木精(碧云天)染色后，使用樹脂(索萊寶)密封載玻片并使用顯微鏡(BX43；Olympus Optical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)觀察。

1.7 免疫熒光檢測SRY-box9(SOX9)表達

BMSCs成骨分化后，將1×105個細胞/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板上，蓋蓋玻片。24 h后使用芝麻素(0、1或10 μmol/L)處理細胞3 d。細胞經(jīng)4%多聚甲醛于25 ℃固定30 min。之后將細胞懸浮于PBS中并用30 mmol/L甘氨酸(Sigma)于25 ℃下淬火5 min，后經(jīng)0.5%Triton-X(索萊寶)于25 ℃下滲透5 min，使用5%脫脂牛奶和2%牛血清白蛋白(BSA)(Gen-View Scientific Inc.，USA)在25 ℃下封閉1 h。應用Sox9兔單克隆抗體(1∶100；#82630，Cell signal Technology，Inc.)于25℃的濕盒中孵育細胞24 h。后使用預冷PBS洗滌細胞，并與Fluor?594山羊抗兔(1∶500；ZSGB-BIO)在25 ℃黑暗中孵育1 h。細胞經(jīng)4’6-二胺基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI；Sigma)染色，由共聚焦激光掃描顯微鏡(FV1000，OLYMPUS)觀察。使用Image-Pro Plus軟件(Media Cybernetics，Rockville，MD，USA)分析結(jié)果。

1.8 Western blot檢測RUNX2、OCN以及Wnt/β-catenin通路相關(guān)抗原表達

成骨細胞分化后，將1×105細胞/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，后在有或無FH535(1 μmol/L)的情況下用芝麻素(0、1或10 μmol/L)處理3 d。收集細胞并使用皮爾斯TM細胞裂解液于4 ℃下裂解20 min后提取蛋白質(zhì)。用10%的分離凝膠和5%的濃縮凝膠進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merch Milliporal Corporation)上。使用5%的脫脂牛奶在25 ℃下封閉2 h，后與小鼠抗RUNX2抗體(1∶5000；ab76956，abcam)，小鼠抗骨鈣素(OCN)抗體(1∶3000；ab13420，abcam)，小鼠抗b-actin抗體(1∶5000；abcam)孵育；ab8226，abcam)，兔抗低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)抗體(1∶1000；ab38311，abcam)，小鼠抗糖原合成酶激酶-3b(gsk-3b)抗體(1∶2000；ab93926，abcam)，兔抗b-連環(huán)蛋白抗體(1∶5000；ab32572，abcam)分別孵育24 h。加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1∶3000；Jackson Immuno Research Laboratory，Inc.，USA)，并在25 ℃下孵育1 h。使用電化學發(fā)光(ECL)分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

定量資料以均值±標準差表示。應用GraphPad“PRISM”軟件(版本5.0；GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA)分析數(shù)據(jù)。單因素方差分析(ANOVA)或t檢驗用于分析多組或兩組間的統(tǒng)計學差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芝麻素對細胞增殖無影響且無細胞毒性

BMSCs成骨分化后用芝麻素(1 μmol/L或10 μmol/L)處理骨髓間充質(zhì)干細胞，以0.1%二甲基亞砜處理后作為正常對照(NC)組。圖1 A顯示NC組、芝麻素(1 μmol/L)組和芝麻素(10 μmol/L)組之間的OD值，無顯著差異(F=0.0683，P=0.9343)。以上結(jié)果表明芝麻素對BMSCs無有細胞增殖及毒性作用。

2.2 芝麻素通過Wnt/β-catenin通路促進BMSCs成骨分化

圖1B顯示了芝麻素在沒有FH535(1 μmol/L)沉默的情況下對RUNX2(F=113.7，P<0.0001)和OCN(F=89.29，P<0.0001)的顯著促進作用。高濃度芝麻素可顯著增強RUNX2和OCN的表達(P<0.05)。FH535沉默后，芝麻素對RUNX2和OCN的促進作用均減弱。雖然其表達增加，但與NC組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1C顯示在沒有FH535(1 μmol/L)沉默的情況下，芝麻素(1 μmol/L或10 μmol/L)對Wnt/β-catenin通路有顯著的促進作用，表現(xiàn)為β-catenin(F=128.60，P<0.0001)和LRP5(F=191.3，P<0.0001)的顯著增加以及gsk-3b的顯著減少(F=69.54，P<0.0001)。較高濃度的芝麻素可進一步促進Wnt/β-catenin通路活性(P<0.05)。FH535(1 μmol/L)沉默后，Wnt/β-catenin活性受到抑制，芝麻素的干預對β-catenin、LRP5或gsk-3b的表達水平的影響無顯著性。

圖2顯示了芝麻素對ALP(圖2 A)(F=23.81，P<0.0001)、OSX(圖2B)(F=73.65，P<0.0001)和SOX9(圖2C)(F=139.1，P<0.0001)的顯著促進作用。隨著芝麻素濃度的升高，對BMSCs成骨分化的促進作用顯著增強(P<0.05)。

圖1 A：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細胞后所得的CCK8吸光度；B：阻斷通路與未阻斷通路狀態(tài)下，各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細胞后RUNX2和OCN的WB表達；C：阻斷通路與未阻斷通路狀態(tài)下，骨髓間充質(zhì)干細胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的WB表達Fig.1 A: CCK8 absorbance of bone marrow mesenchymal stem cells treated with sesamin at various concentrations; B: Expression of RUNX2 and OCN after treatment of bone marrow mesenchymal stem cells with sesamin at different concentrations in the blocked and unblocked pathways; C: WB expression of Wnt/b-catenin pathway-related proteins in bone marrow mesenchymal stem cells under blocked and unblocked pathways.注：NC組：陰性對照組，0.1%二甲亞砜處理；1組：1 μmol/L芝麻素處理；10組：10 μmol/L芝麻素處理；與NC組比較，*P<0.05；與NC組和1組比較，#P<0.05；與NC+FH535組比較，**P>0.05。

圖2 A：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細胞后ALP的染色表達；B：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細胞后OSX的免疫組化表達；C：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細胞后SOX9的免疫熒光表達Fig.2 A: ALP staining and expression in bone marrow mesenchymal stem cells treated with sesamin at various concentrations; B: Immunohistochemical expression of OSX in bone marrow mesenchymal stem cells treated with sesamin at different concentrations; C: Immunofluorescence expression of SOX9 after treatment in bone marrow mesenchymal stem cells.注：NC組：陰性對照，0.1%二甲亞砜處理；1組：1 μmol/L芝麻素處理；10組：10 μmol/L芝麻素處理；與NC組比較，*P<0.05；與NC組和1組比較，#P<0.05。

以上結(jié)果表明，本實驗條件下，芝麻素激活Wnt/β-catenin信號通路，并促進BMSCs向成骨細胞分化。

3 討論

本研究應用不同濃度的芝麻素(1 μmol/L或10 μmol/L)干預由SD大鼠股骨分離而來的骨髓間充質(zhì)干細胞，共3 d。結(jié)果表明，芝麻素處理后細胞ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN的表達均顯著增強。此外，10 μmol/L的芝麻素對上述蛋白表達的促進作用高于1 μmol/L的芝麻素。通過Western blotting檢測Wnt/β-catenin通路表達，結(jié)果顯示芝麻素對β-catenin和LRP5水平的上調(diào)，但對GSK-3b水平的下調(diào)，呈濃度依賴性。為證實Wnt/β-catenin在芝麻素促進BMSCs成骨分化中的關(guān)鍵作用，研究使用FH535(1 μmol/L)沉默Wnt/β-catenin，后測定相關(guān)蛋白的表達。Western blotting結(jié)果顯示，沉默Wnt/β-catenin通路后芝麻素干預組與非沉默空白對照組相比，RUNX2和OCN的表達無顯著差異。以上結(jié)果表明芝麻素通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑促進BMSCs的成骨分化。

一些生物標志物已被證實在骨質(zhì)疏松的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。ALP[19]、OSX[20]、SOX9[21]、RUNX2[22-23]和OCN[23]已被證實與骨質(zhì)疏松有關(guān)。與健康人相比，骨質(zhì)疏松患者的ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN通常較低。此外，RUNX2在調(diào)節(jié)成骨細胞和軟骨細胞分化中起關(guān)鍵作用[24-25]。因此，ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN可作為骨質(zhì)疏松或成骨分化的生物標志物。先前的研究已經(jīng)證明Wnt/β-catenin途徑在骨質(zhì)疏松的發(fā)病和進展中具有關(guān)鍵作用，也被認為是治療骨質(zhì)疏松的靶點[26-30]。本研究中，芝麻素處理提高了ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN水平，并激活了BMSCs中的Wnt/β-catenin信號通路。以上結(jié)果表明芝麻素具有促進成骨細胞分化的能力，并具有通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑對骨質(zhì)疏松具有治療和預防作用，故而芝麻素可能是治療骨質(zhì)疏松的新靶點。

綜上，本研究初步證實芝麻素具有調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路促進BMSCs向成骨細胞分化的潛能，顯示了其對骨質(zhì)疏松的潛在治療和預防作用。