周皖舒 陶周善 顧長(zhǎng)斌*

1.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，安徽 蕪湖 241000 2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(弋磯山醫(yī)院)創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡相關(guān)的全身性疾病，以進(jìn)行性骨量丟失、骨強(qiáng)度降低和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征[1]。絕經(jīng)后的婦女特別容易受到這種骨代謝紊亂的影響。在育齡期間，雌激素通過(guò)刺激成骨細(xì)胞活動(dòng)來(lái)幫助維持女性的骨量。絕經(jīng)后婦女雌激素水平降低導(dǎo)致成骨細(xì)胞骨形成速率降低，導(dǎo)致骨吸收凈增加[2]。此外，絕經(jīng)后婦女成骨細(xì)胞增殖減少，導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化增強(qiáng)和過(guò)度活躍，進(jìn)而骨質(zhì)丟失。有學(xué)者報(bào)道阿司匹林(aspirin，ASP)[3]可能具有抑制骨吸收作用，隨后的流行病學(xué)報(bào)告還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常使用小劑量的ASP或其他非甾體抗炎藥經(jīng)常與骨密度增加相關(guān)[4]。已經(jīng)有基礎(chǔ)研究報(bào)道ASP具有保護(hù)去卵巢大鼠骨量和骨密度的作用[5]。雷奈酸鍶(strontium ranelate，SR)是雷尼酸的一種鍶鹽，目前正被用作治療骨質(zhì)疏松癥的抗吸收藥物。鍶在骨重建中起著特殊的作用，鍶通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性減少骨吸收，通過(guò)刺激成骨細(xì)胞活性促進(jìn)骨形成[6-7]。鑒于阿司匹林和雷奈酸鍶均有抗骨質(zhì)疏松癥的效果，本研究觀察阿司匹林聯(lián)合雷奈酸鍶使用對(duì)成骨細(xì)胞以及對(duì)去卵巢大鼠骨量和骨密度的影響，兩者聯(lián)合治療骨質(zhì)疏松癥的可行性。

1 資料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

來(lái)源于新生小鼠顱骨的MC3T3-E1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)典型培養(yǎng)委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)， α-MEM培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清(FBS)和1%鏈霉素青霉素(100 U/mL)。將MC3T3-E1細(xì)胞接種于成骨分化培養(yǎng)基中，24 h后不加入任何藥物(Con組)，或者分別加入5 mmol/L的SR(SR組)、加入2 mmol/L的ASP(ASP 組)及同時(shí)加入5 mmol/L的SR和2 mmol/L的ASP(SR+ASP組)，共培養(yǎng)14 d后，用4%多聚甲醛固定15 min，用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(Beyotime，中國(guó)上海)進(jìn)行堿性磷酸酶染色。堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(Beyotime，中國(guó)，上海)根據(jù)制造商的說(shuō)明測(cè)定ALP活性，并用微量分光光度計(jì)在405 nm處讀出活性量。茜素紅S染色30 min，對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行可視化。為了定量評(píng)價(jià)，本研究用10%的十六烷基氯化吡啶去細(xì)胞15 min，上清液在540 nm處讀數(shù)。

1.2 去卵巢模型建立和指標(biāo)檢測(cè)

3個(gè)月大的雌性SD大鼠從弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室獲取，并在控制溫度(22℃～24℃)和濕度(50%～60%)的條件下，保持12 h明暗周期。自由獲取標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物飲食和水。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。根據(jù)FDA指南對(duì)動(dòng)物進(jìn)行背側(cè)雙側(cè)切除卵巢手術(shù)OVX或假手術(shù)。12周后，隨機(jī)選擇20只大鼠(每組10只)以通過(guò)測(cè)試骨密度(BMD)驗(yàn)證成功的建模。然后將大鼠分為4組，每組10只：OVX(OVX大鼠+生理鹽水)，ASP[OVX+ASP，9 mg/(kg·d)]，SR[OVX+SR，300 mg/(kg·d)]，SR+ASP[OVX+ASP，9 mg/(kg·d)+SR，300 mg/(kg·d)]。大鼠的ASP或SR的劑量參考發(fā)表的文獻(xiàn)[8-9]。治療12周后，取出左股骨，在10%中性福爾馬林緩沖液中固定24 h，隨后進(jìn)行Micro-CT檢查和組織切片HE染色檢測(cè)。將右股骨切片并在液氮中冷凍，用于蛋白質(zhì)印跡(WB)分析。

Micro-CT檢查：左股骨通過(guò)錐形束臺(tái)式Micro-CT(μCT80，Scanco Medical，Brüttisellen，Switzerland)測(cè)量，并通過(guò)相關(guān)分析軟件進(jìn)行評(píng)估(μCT80 Evaluation Program v6.5 1，Scanco Medical，Switzerland)。掃描后，選擇生長(zhǎng)板上方1 mm處股骨遠(yuǎn)端的松質(zhì)骨作為VOI，將其限制在股骨內(nèi)部區(qū)域，通過(guò)CT分析儀軟件繪制自由形狀的輪廓來(lái)提取骨小梁和皮質(zhì)骨。使用標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)表征松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)，以確定相對(duì)骨體積(BV/TV，%)，骨小梁厚度(Tb.Th，mm)，骨小梁數(shù)目(Tb.N，1/mm)，骨小梁分離度(Tb.Sp，mm)和骨密度(BMD，g/cm2)；通過(guò)多平面重整獲得三維(3D)圖像。

隨后左股骨進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，用乙二胺四乙酸溶液(EDTA)(Servicebio，G1105)將固定的左股骨脫鈣4～6周。樣品用標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)的酒精溶液脫水并包埋在石蠟中。將石蠟中的骨組織縱向切成4 μm的薄片。載玻片用于蘇木精和曙紅(HE)染色。

接下來(lái)對(duì)右側(cè)股骨進(jìn)行蛋白印跡(western blot，WB)檢測(cè)，在液氮中粉碎后用IP裂解緩沖液從骨組織中提取總蛋白。通過(guò)BCA蛋白質(zhì)試劑盒定量測(cè)量蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合，并在100℃下煮沸5 min以使其變性。 將50 μg總蛋白通過(guò)10%和15%SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到0.45 m的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜中。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將膜分別與購(gòu)于Abcam的Notch 1、CBF 1和Jagged 1一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后在室溫下與綴有辣根過(guò)氧化物的二抗一起孵育1 h。印跡用ECL試劑(Thermo Scientific，美國(guó))顯影。β-actin蛋白用于標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)Image J軟件測(cè)量每個(gè)蛋白條帶的總密度。

圖1 每組大鼠中ALP和茜素紅染色以及平均光密度Fig.1 Average optical density of ALP and Alizarin red staining in each group

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，使用Leven檢驗(yàn)方差的同質(zhì)性。通過(guò)單向方差分析(ANOVA)和最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)確定特定組之間的差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 ALP染色和茜素紅染色結(jié)果分析

如圖1所示，ALP陽(yáng)性細(xì)胞染色后呈藍(lán)紫色，其中以SR+ASP組ALP陽(yáng)性細(xì)胞最多。茜素紅陽(yáng)性細(xì)胞染色后呈紅色，其中以SR+ASP組茜素紅陽(yáng)性細(xì)胞最多。根據(jù)ALP和茜素紅染色的平均光密度的統(tǒng)計(jì)分析(圖1)，SR+ASP組的ALP陽(yáng)性細(xì)胞和茜素紅陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度與SR組和ASP組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SR組和ASP組之間，ALP陽(yáng)性細(xì)胞和茜素紅陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度也發(fā)現(xiàn)有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果表明SR+ASP組成骨細(xì)胞活性和礦化功能更強(qiáng)。

2.2 Micro-CT分析

Micro-CT更好地顯示了股骨干骺端骨小梁的總體改變情況，骨小梁的微觀參數(shù)如圖2所示。ASP組、SR組、SR+ASP組左側(cè)股骨干骺端骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較OVX組明顯升高，而Tb.Sp較OVX組明顯降低 (P<0.05)；而SR+ASP組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較ASP組和SR組明顯升高，而Tb.Sp較ASP組和SR組明顯降低(P均<0.05)。

2.3 大鼠組織學(xué)變化

HE結(jié)果表明，SR聯(lián)合ASP治療能更好地保護(hù)去卵巢大鼠骨量的流失。如圖3所示，與OVX組相比，ASP、SR及SR+ASP組的大鼠骨小梁數(shù)量和密度得到明顯的改善，而在SR+ASP組表現(xiàn)的最為明顯。

圖2 4組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of micro-CT in the femoral metaphysis of rats in the four groups注： OVX組(a)、ASP組(b)、SR組(c)及SR+ASP組(d)；與OVX組相比，*P<0.05；與ASP組相比，#P<0.05；與SR組相比，&P<0.05。

圖3 4組大鼠股骨干骺端HE切片檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of HE slices in the femoral metaphysis of rats in the four groups注：OVX組(A)、ASP組(B)、SR組(C)及SR+ASP組(D)(×20)。

2.4 Notch信號(hào)通路改變

和OVX組比較，ASP組、SR組及SR+ASP組的大鼠Notch信號(hào)通路被激活；Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達(dá)上調(diào)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和ASP組和SR組比較，SR+ASP組Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達(dá)水平顯著升高，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 使用WB檢測(cè)Notch 1、CBF 1和Jagged 1和β-actin的相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative expression of Notch 1, CBF 1, and Jagged 1 to β-actin using Western blotting注：與OVX組相比，*P<0.05；與ASP組相比，#P<0.05；與SR組相比，&P<0.05。

3 討論

以前有報(bào)道稱(chēng)，一旦雌性大鼠被切除卵巢，觀察到的骨質(zhì)疏松癥的主要表現(xiàn)是破骨細(xì)胞數(shù)量增加，溶骨作用增強(qiáng)和高骨轉(zhuǎn)換，骨吸收超過(guò)骨形成。在人類(lèi)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中觀察到的骨代謝變化與卵巢切除(OVX)大鼠的骨代謝變化之間有許多相似之處，因此，OVX大鼠被認(rèn)為是絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的有效動(dòng)物模型[10]。因此本研究選取去卵巢大鼠作為研究模型探討使用SR和ASP聯(lián)合療法防治雌激素缺乏大鼠的骨質(zhì)流失。OVX大鼠用SR和ASP聯(lián)合治療12周。Micro-CT和HE染色切片結(jié)果顯示，SR組和ASP組股骨骨密度較OVX組明顯增加，骨小梁的結(jié)構(gòu)得到了顯著改善；而SR+ASP組骨密度以及骨小梁微觀結(jié)構(gòu)較SR組和ASP組均勻明顯改善。

本研究發(fā)現(xiàn)SR+ASP組取得較好的療效可能和每種藥物單獨(dú)作用機(jī)制有關(guān)。以前的研究表明ASP通過(guò)作用于Fas/FasL信號(hào)通路，抑制T淋巴細(xì)胞對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的凋亡作用，促進(jìn)成骨分化，抑制破骨細(xì)胞分化，從而干預(yù)骨壞死的發(fā)生發(fā)展[3，11]。另外，環(huán)氧合酶-2(COX-2)可能通過(guò)改變基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)和白細(xì)胞介素(IL)-6(21)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)骨吸收。ASP是COX-2的有效抑制劑，也可能降低COX-2，從而抑制骨質(zhì)疏松時(shí)骨吸收的發(fā)展[12]。SR是為數(shù)不多的針對(duì)骨質(zhì)疏松的藥物之一，它既能刺激成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨形成，又能抑制破骨細(xì)胞(減少骨吸收)[6-7]，從而減少脊椎和非脊椎骨折[13]。由于SR和ASP均具有促進(jìn)成骨和抑制破骨作用，SR+ASP組取得較好的療效可能和兩者作用機(jī)制疊加有關(guān)。

在哺乳動(dòng)物中，Notch家族有4個(gè)受體Notch1-4和5個(gè)受體結(jié)合配體Jagged1/2和δ樣1/3/4[14]。當(dāng)同源配體與Notch受體結(jié)合時(shí)，Notch信號(hào)被激活，導(dǎo)致γ分泌酶的一系列蛋白水解和Notch胞內(nèi)信號(hào)的釋放[15]。先前的研究表明，Notch信號(hào)通路是骨形成的調(diào)節(jié)因子，Notch信號(hào)激活可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化[16]。由于Notch信號(hào)通路在骨形成中的重要作用，本研究進(jìn)一步探索了各組大鼠骨組織中Notch信號(hào)通路改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較Con組，ASP組、SR組以及SR+ASP組Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達(dá)明顯上調(diào)，而SR+ASP組Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達(dá)上調(diào)最為顯著，這表明SR聯(lián)合ASP治療可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)；由于Notch信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化及增殖的重要作用，因此可以解釋SR+ASP組更高的骨量和骨密度，說(shuō)明兩者聯(lián)合使用對(duì)骨形成刺激作用更強(qiáng)。

總的來(lái)說(shuō)，本研究初步使用雷奈酸鍶聯(lián)合阿司匹林干預(yù)去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥，結(jié)果表明聯(lián)合使用較單獨(dú)使用效果更佳，而這種療效可能通過(guò)Notch信號(hào)通路介導(dǎo)。由于本研究使用的模型以及樣本量有限，因此有必要進(jìn)一步探索這種治療方案的優(yōu)勢(shì)；而且本研究選取藥物劑量也是參考文獻(xiàn)，是否是最佳劑量還需要進(jìn)一步研究。