梁嘉偉，白麗,2*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

白色念珠菌又稱白假絲酵母菌，是一種人類共生的條件致病菌，主要存在于人類胃腸道和泌尿生殖道。白色念珠菌在正常個(gè)體內(nèi)是無(wú)害的，但隨著宿主免疫功能的下調(diào)或機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，體內(nèi)正常的微生物群平衡被打破，引起白色念珠菌異常增殖，導(dǎo)致宿主被感染。近年來(lái)，大量免疫制劑、抗生素等的濫用和植入性醫(yī)療器材的應(yīng)用，導(dǎo)致念珠菌相關(guān)疾病如鵝口瘡、口角炎、念珠菌性陰道炎等疾病的發(fā)病率逐年上升。微生物黏附在組織表面時(shí)，由自身產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)包裹形成一種膜狀結(jié)構(gòu)，被稱為生物被膜，這是其在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為順應(yīng)外界環(huán)境壓力而形成的。白色念珠菌在生物或非生物表面定植并形成生物膜的能力是其主要毒力因子，生物膜的存在可以保護(hù)菌體免受宿主免疫反應(yīng)的影響，限制膜外物質(zhì)利用基質(zhì)進(jìn)行滲透，幫助菌體逃避抗菌藥物的殺傷作用，提高菌體對(duì)于各種抗真菌藥物的耐藥性，造成慢性且難治愈的感染[1]。此外，形成了生物膜的菌體在體內(nèi)遷移擴(kuò)散，導(dǎo)致炎癥反復(fù)發(fā)作，已成為臨床診療的一大難題。因此，尋找高效低毒且對(duì)抗生物膜的新型藥物迫在眉睫。

1 白色念珠菌生物膜的形成及其耐藥機(jī)制

研究表明，白色念珠菌體外生物膜的發(fā)育主要分為黏附、聚集。

1.1 粘附

白色念珠菌為雙相菌，正常情況下一般為酵母相，致病時(shí)轉(zhuǎn)化為菌絲相。在生物膜發(fā)育的早期（0～11 h），單個(gè)細(xì)胞粘附在宿主黏膜表面或醫(yī)療器械上，形成了生物膜的基底層。白色念珠菌在宿主黏膜表面或醫(yī)療器械上的粘附能力對(duì)白色念珠菌生物膜的形成至關(guān)重要，影響白色念珠菌在宿主體內(nèi)的侵襲和擴(kuò)散。Martin 等人[2]發(fā)現(xiàn)SMI1 蛋白在菌體細(xì)胞中的功能可以影響細(xì)胞的粘附等功能，敲除SMI1 等位基因可導(dǎo)致細(xì)胞壁硬度降低，粘附分子的表面表達(dá)程度降低，進(jìn)一步影響生物膜對(duì)細(xì)胞的粘附性，損傷細(xì)胞完整性，菌體對(duì)卡泊芬凈、氟康唑等抗真菌藥物表現(xiàn)為低耐藥性。

1.2 聚集

在生物膜發(fā)育的中期（12～30 h），可見(jiàn)粘附在宿主和器械上的生物膜產(chǎn)生菌絲、偽菌絲，細(xì)胞開(kāi)始分泌多聚糖（細(xì)胞外基質(zhì)主要組成部分），附著的酵母細(xì)胞長(zhǎng)成了薄層細(xì)胞。菌絲與生物膜的形成密切相關(guān)，生物膜的菌絲含量影響生物膜的抗壓強(qiáng)度：菌絲含量越高的生物膜具有更高的抗壓強(qiáng)度，更難被渦旋和超聲波等手段破壞。Zhou 等[3]發(fā)現(xiàn)木蘭醇可以抑制白色念珠菌的菌絲形成，從而阻止念珠菌形成生物膜。

1.3 成熟和播散

生物膜發(fā)育后期（31～72 h），白色念珠菌形成了成熟的生物膜，該生物膜是在細(xì)胞外基質(zhì)包裹下的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈有機(jī)三維立體小菌落結(jié)構(gòu)，具有不均質(zhì)性和水道分支[4]。細(xì)胞外基質(zhì)包裹著細(xì)胞，厚度可達(dá)450 μm，雙向性的白色念珠菌細(xì)胞和外包的基質(zhì)組成了典型的生物被膜。當(dāng)成熟到一定程度時(shí)，成熟的生物膜通過(guò)調(diào)控N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的濃度達(dá)到閾值，結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子而被激活，刺激自身部分脫落，再黏附形成新的生物膜，再次進(jìn)入血液中，進(jìn)一步引發(fā)其他疾病。

2 白色念珠菌生物膜的耐藥機(jī)制

2.1 細(xì)胞密度對(duì)白色念珠菌耐藥性的影響

白色念珠菌細(xì)胞密度與生物被膜的耐藥性有關(guān)。Seneviratne 等人[5]研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌生物膜耐藥性隨細(xì)胞密度升高而升高，高密度的浮游型白念珠菌細(xì)胞對(duì)高濃度的唑類藥物具有耐受性。Perumal等人[6]也在研究中發(fā)現(xiàn)隨著白色念珠菌細(xì)胞密度上升，菌體的抗菌力增加，對(duì)藥物的耐受機(jī)制也發(fā)生改變，支持了生物膜內(nèi)細(xì)胞的物理密度對(duì)抗真菌藥物產(chǎn)生抗藥性的觀點(diǎn)。

2.2 細(xì)胞外基質(zhì)

研究證明，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）是生物被膜耐藥性的基本機(jī)制之一，增強(qiáng)了抗菌素耐藥性并保護(hù)其免受宿主免疫反應(yīng)的影響。ECM 可以作為吸附劑，減少抗菌素與生物膜相互作用，這種結(jié)構(gòu)通過(guò)隔開(kāi)通往生物膜區(qū)域的通道在物理層面上減少了抗菌劑的滲透，作為一種物理屏障，保護(hù)嵌在生物膜中的細(xì)胞不受抗菌藥物的侵襲，從而增加生物膜的耐藥性。β-1,3 葡聚糖是細(xì)胞外基質(zhì)的主要碳水化合物成分之一，能與氟康唑結(jié)合，阻止該藥物達(dá)到其細(xì)胞靶點(diǎn)，起到“藥物海綿”的作用，并對(duì)白色念珠菌生物被膜產(chǎn)生抗藥性。除了藥物隔離，已經(jīng)證明白色念珠菌生物膜產(chǎn)生β-1,3 葡聚糖會(huì)阻礙中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，并保護(hù)生物膜中的細(xì)胞免受中性粒細(xì)胞的殺傷[7]。

2.3 麥角甾醇

麥角甾醇是一種負(fù)責(zé)膜流動(dòng)性和通透性以及真菌整膜蛋白功能的脂質(zhì)，生物膜的麥角甾醇水平會(huì)影響生物膜的耐藥性。與早期生物膜相比，中期和成熟期的麥角甾醇水平顯著降低，這表明生物膜對(duì)唑類藥物的高耐藥性可能是通過(guò)降低生物膜中麥角甾醇水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，使用香茅醛還可以破壞細(xì)胞膜，降低50%的麥角甾醇水平，并通過(guò)減少葡萄糖誘導(dǎo)的H+排出來(lái)降低質(zhì)膜ATP 酶的活性，進(jìn)一步達(dá)到抑制生物膜活性的目的[8]。同樣的，大量研究也報(bào)道了丁香酚及其衍生物可以抑制麥角甾醇的生物合成，破壞細(xì)胞膜的完整性，形成對(duì)白色念珠菌生物膜的殺傷[9]。

2.4 藥物外排泵

白色念珠菌耐藥性的一個(gè)重要機(jī)制是外排泵的過(guò)度表達(dá)，將藥物輸出到細(xì)胞外。研究表明，有兩種主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與這種耐藥機(jī)制：（1）ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）蛋白超家族，通過(guò)水解ATP 以提供能量驅(qū)動(dòng)藥物外流；（2）主要促進(jìn)劑超家族（Major Facilitator Superfamily，MFS）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要通過(guò)利用跨質(zhì)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度擠出底物。在白色念珠菌基因組編碼的26個(gè)ABC 超家族成員中，念珠菌耐藥蛋白1（CaCdr1）和耐藥蛋白2（CaCdr2）是兩種主要的外排蛋白，其與編碼主要促進(jìn)劑的基因MDR1 的過(guò)表達(dá)降低了真菌細(xì)胞中氟康唑的有效濃度，對(duì)臨床上的唑類藥物起著關(guān)鍵的耐藥作用，但研究表明這3 種基因只在生物膜的早期耐藥中起作用[10]。

2.5 藥物防治

新型抗菌體生物膜藥物ClTI 是從決明子中分離純化的一種庫(kù)尼茨胰蛋白酶抑制劑，可以通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和壞死對(duì)白色念珠菌產(chǎn)生殺滅作用。研究表明，使用2.1 μmol/L 的ClTI 處理白色念珠菌后顯示嚴(yán)重的細(xì)胞形態(tài)畸形，有34.30% 的抑菌率；此外，還可使預(yù)先形成的成熟生物膜的生物量減少38.58%[11]。研究發(fā)現(xiàn)，三環(huán)類抗抑郁藥TCA 也可以抑制白色念珠菌的生長(zhǎng)和生物被膜的形成：經(jīng)過(guò)TCA 處理后，對(duì)生物膜發(fā)育極其重要的基因BCR1 和EFG1 以及介導(dǎo)生物膜粘附的細(xì)胞表面蛋白ALS1 的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。TCA 在MIC99（抑制99%受試菌所需藥物最低濃度）時(shí)，細(xì)胞和生物膜都受到強(qiáng)烈抑制，只有不到0.001% 的細(xì)胞存活；在MIC10（抑制10%受試菌所需藥物最低濃度）水平時(shí)，TCAs 也將細(xì)胞數(shù)量減少到活細(xì)胞的1%以下，且抑菌濃度都在臨床可接受的治療抑郁癥劑量范圍內(nèi)[12]。研究證實(shí)，經(jīng)過(guò)β-香茅醇處理后的白色念珠菌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，在MIC（最小抑菌濃度）水平時(shí)，至少能使白色念珠菌數(shù)量減少70%；在1/2MIC 水平時(shí)，仍能抑制40% 的白色念珠菌生物膜形成；未處理的細(xì)胞生物膜相對(duì)致密，經(jīng)處理后的細(xì)胞生物膜形成有缺陷，從而使得其毒力減弱[13]。

3 結(jié)語(yǔ)

生物被膜不僅是白色念珠菌形態(tài)多樣性的表現(xiàn)，更是對(duì)宿主環(huán)境變化的一種適應(yīng)性策略。生物被膜的形成為白色念珠菌的定殖和侵染提供了更加有利的條件，同時(shí)也為臨床上預(yù)防和治療白色念珠菌病帶來(lái)了困難和挑戰(zhàn)。近年來(lái)，人們對(duì)白色念珠菌生物被膜的研究越來(lái)越深入，尤其在生物被膜的形成和分子調(diào)控機(jī)制、MTL 依賴性生物被膜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及耐藥性形成的分子機(jī)制等方面取得了重大進(jìn)展，但該領(lǐng)域仍存在很多問(wèn)題亟待進(jìn)一步研究。這些研究將有助于加深人們對(duì)白色念珠菌生物被膜的生物學(xué)特性及分子調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)和了解，為臨床上防治白色念珠菌引起的感染提供理論依據(jù)，并為新型抗真菌藥物的研發(fā)提供新思路。