胡建軍，沈超*

（1.武漢大學 病毒學國家重點實驗室，湖北武漢 430072；2.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，湖北武漢 430072）

口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈RNA病毒；全基因組共8 500 nt，編碼一個多聚蛋白。在細胞內(nèi)，該多聚蛋白被蛋白酶連續(xù)切割，產(chǎn)生成熟的結構蛋白和非結構蛋白，組成病毒外殼和復制“機器”，但非結構蛋白并不出現(xiàn)在成熟的病毒粒子中[1]。FMDV主要感染豬、牛、羊等偶蹄動物，導致宿主出現(xiàn)發(fā)熱、斑疹、跛足等嚴重的臨床癥狀。在流行地區(qū)采取的主要措施是接種疫苗，但現(xiàn)有的疫苗只能預防FMDV的感染，無法清除已感染宿主體內(nèi)的病毒。目前，對于已感染動物采取的措施是全部銷毀，造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，抑制病毒基因組RNA復制，清除宿主體內(nèi)的病毒或可成為治療FMDV的良好策略[2]。

許多單股正鏈RNA病毒感染細胞后，在病毒蛋白和被劫持的宿主因子作用下導致內(nèi)膜系統(tǒng)重塑，形成一種被稱為復制復合體的膜狀結構促進這些病毒基因組的復制，協(xié)調病毒復制周期，保護病毒RNA逃避宿主免疫應答，對病毒的感染至關重要[3-4]。FMDV感染的宿主細胞內(nèi)膜系統(tǒng)重構，形成了“類膜細胞器”，其中包含了一些源自FMDV的非結構蛋白和源自宿主細胞的細胞因子[5]。暗示可能像其他單股正鏈RNA病毒一樣，復制復合體在FMDV的感染過程中也發(fā)揮著重要的作用。本文將結合近年來的相關研究，從結構、功能、主要成分的生物學意義3方面對FMDV的復制復合體進行介紹。

1 FMDV復制復合體的結構

病毒作為介于生命和非生命的微小顆粒，自身并無完整的遺傳-代謝系統(tǒng)。擴增其基因組和產(chǎn)生有傳染性的子代病毒必須依賴宿主細胞。正鏈RNA病毒的復制一般發(fā)生在由病毒蛋白和宿主細胞因子共同誘導產(chǎn)生的復制復合體中。FMDV的復制復合體包括一個蛋白質-蛋白質和蛋白質-RNA相互作用的協(xié)調網(wǎng)絡，涉及多種病毒和宿主細胞因子。在透射電鏡下觀察FMDV感染后的IBRS-2細胞，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體腔出現(xiàn)明顯的腫脹，且在高爾基體附近出現(xiàn)大量囊泡狀結構[6]。但關于FMDV復制復合體的三維結構大小的測量未見報道。

2 FMDV復制復合體的功能

2.1 調控FMDV的生活周期

FMDV感染宿主細胞后，宿主細胞的核糖體亞基識別基因組RNA并以不依賴帽子的方式進行翻譯，翻譯所得的多聚蛋白在蛋白酶的作用下切割成熟；隨后以尿苷?；腣Pg為引物，以基因組RNA為模版，轉錄合成互補的負鏈RNA分子；基因組RNA與其轉錄出的負鏈RNA形成雙鏈“復制中間體”，并以負鏈RNA為模板合成大量的病毒基因組RNA，新合成的正鏈RNA又可以作為翻譯和轉錄的模板。在特定的包裝信號作用下，新合成的病毒基因組RNA與病毒蛋白外殼組裝成未成熟的FMDV粒子[7]。FMDV基因組RNA的翻譯、轉錄、復制、病毒粒子的包裝等過程都發(fā)生在復制復合體中，復制復合體通過某種未被闡明的機制確保這一系列過程在宿主細胞內(nèi)高效有序的進行。

2.2 為FMDV的生活周期提供穩(wěn)定的微環(huán)境

復制復合體作為一種“另類”的膜狀細胞結構，一方面調控了整個膜結構內(nèi)外的物質交換，使得膜結構內(nèi)部FMDV翻譯、轉錄、復制、病毒粒子的組裝所需的成分維持較高的局部濃度，并提供所需的錨定位點，有利于這些生活周期的高效進行[8]；另一方面，其膜結構作為屏障使FMDV的翻譯、轉錄、復制獨立于宿主細胞，使得病毒的生活周期免受外界干擾，從而幫助病毒進行免疫逃逸[9]。

3 FMDV復制復合體組成成分及功能

3.1 復制復合體中的脂質及其生物學功能

脂質是FMDV乃至所有正鏈RNA病毒復制復合體的主要成分，是復制復合體的結構基礎。與其他小RNA病毒類似，F(xiàn)MDV感染BHK細胞和IBRS-2細胞產(chǎn)生大量的囊泡。FMDV復制復合體脂質的重要來源是內(nèi)膜系統(tǒng)的重塑，抑制Sar1的水平來抑制內(nèi)質網(wǎng)上COPⅡ轉運膜泡的形成能抑制FMDV的感染，而抑制Arf1和Rab1的水平從而抑制高爾基體上COPⅠ轉運膜泡和分泌膜泡的形成不能抑制FMDV的感染。給予布雷菲德菌素A（BFA）破壞高爾基體的結構也無法抑制FMDV復制復合體的形成和病毒的感染[10]，這表明FMDV復制復合體中直接來源于宿主細胞器的部分可能是由內(nèi)質網(wǎng)而非高爾基體提供。

小RNA病毒科復制復合體脂質的另一個重要來源是利用宿主的代謝系統(tǒng)進行合成。在受感染的細胞中，Ⅲ型磷脂酰肌醇4激酶（PI4KⅢ）產(chǎn)生高水平的PI4P，然后在復制復合體中將其轉換為膽固醇。對于許多小RNA病毒，復制復合體是在利用PI4KⅢβ的過程中在高爾基體膜上形成的，而FMDV復制不需要PI4KⅢ。在受FMDV感染的細胞中，PI4P水平不會增加，在復制復合體中也無法檢測到PI4P[10]，這表明FMDV對復制復合體膜上的脂質有獨特的需求，但新合成的這一部分脂質由何種細胞因子調控未見報導。

3.2 復制復合體中的病毒非結構蛋白質及其生物學功能

復制復合體病毒自身的蛋白質和宿主細胞中被病毒劫持的細胞因子協(xié)同作用，共同調節(jié)FMDV感染的進程。FMDV非結構蛋白2C在小RNA病毒科復制復合體中高度保守，也是FMDV復制復合體中的關鍵蛋白[11]。Bienz等[12]研究發(fā)現(xiàn)，2C的N端具有兩親性螺旋（殘基17-34），具有結合細胞膜的能力，是膜重排和病毒復制復合體形成所必需的。2C的C端還有一個對腸病毒和脊髓灰質炎病毒感染非常重要 ATPase結構域（殘基 60～270）[13]，但 2C在FMDV的復制復合體中的功能未被闡明。Barton等[14]發(fā)現(xiàn)靠近FMDV 3A蛋白的細胞質RNA解旋酶A（RHA）促進了復制復合體以及細胞poly(A)結合蛋白（PABP）的組裝，免疫共沉淀證實這些蛋白質與RHA形成復合物。Hesterberg等[15]在電鏡下觀察到宿主細胞中FMDV 3Dpol聚集在復制復合體膜上，3Dpol能與FMDV基因組RNA相互作用，其RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）活性是FMDV的RNA復制所必需的。小RNA病毒科中腸道病毒3C已被證實參與到復制復合體中[16]。FMDV 3C蛋白對翻譯后多聚蛋白的切割成熟和幫助病毒進行免疫逃逸至關重要，但其是否定位于復制復合體中未見報導。

3.3 復制復合體中的宿主細胞因子及其生物學功能

一些宿主細胞因子也能通過與病毒的蛋白互作在復制復合體中發(fā)揮作用。Beclin1是自噬過程的調控因子,通過標記膜形成吞噬體，參與自噬通路的啟動并介導自噬體和溶酶體的融合[17]。Gladue等[18]通過酵母雙雜交實驗證實Beclin1是2C的天然配體，在FMDV感染的細胞中未見溶酶體與含有病毒蛋白的自噬體的融合，過表達Beclin1后則出現(xiàn)了融合。這一現(xiàn)象表明2C可以結合Beclin1來阻止溶酶體與自噬體的融合，從而有利于病毒逃脫宿主細胞的“清理”。波形蛋白（Vimentin）已被證明在多種病毒的復制周期中起著重要的作用，與牛痘病毒和登革熱病毒的病毒復制過程有關[19-20]。Gladue等[21]證實在FMDV感染的MCF-10A細胞中，2C和Vimentin存在蛋白互作，共同參與FMDV復制復合體的形成；通過免疫熒光技術觀察到圍繞FMDV蛋白2C的Vimentin籠狀結構的瞬時形成，破壞Vimentin的生理結構后FMDV復制能力顯著降低。復制復合體結構微小，成分復雜，其內(nèi)的許多成分和具體的功能仍待進一步研究。

4 結論與展望

構成FMDV復制復合體膜成分的脂質主要有兩大來源，一是來源于內(nèi)質網(wǎng)膜重塑，這一過程的關鍵調控因子仍未確定；二是來源于脂質的從頭合成，且不依賴于小RNA病毒科常見的PI4KⅢ，具體由何種因子調控仍未見報導。構成FMDV復制復合體的另一種主要成分——蛋白質，主要包含病毒自身的非結構蛋白和宿主的細胞因子。參與復制復合體的病毒非結構蛋白有2C、3A和3Dpol，3C也可能是復制復合體蛋白；Beclin 1和Vimentin是已知的屬于宿主細胞因子的復制復合體蛋白，能與2C產(chǎn)生蛋白質互作。但這些蛋白在FMDV復制復合體中的功能仍待進一步研究，復制復合體中許多未被確認的成分也急需后續(xù)研究者進行探索。

FMDV基因組的復制和產(chǎn)生有傳染性的子代病毒均與病毒復制復合體有關，復制復合體對病毒翻譯、轉錄、復制進行時空調控，確保這些過程必需的成分保持一定的局部濃度，并保護其不受胞質環(huán)境影響，對于FMDV的感染至關重要。闡明復制復合體的組成成分及其功能有助于更進一步研究FMDV的感染機制和開發(fā)有針對性的治療FMDV的藥物。