馬樂，張博，何斌，陳高峰，顧興，李林

（北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京 100176）

滅菌指用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段將物品中活的微生物殺死或除去的過程。濕熱滅菌法是將物品置于滅菌設(shè)備內(nèi)，利用飽和蒸汽殺死微生物的方法。濕熱滅菌應(yīng)考慮被滅菌物品的熱穩(wěn)定性、熱穿透性以及生物負(fù)載等因素。采用濕熱滅菌方法時(shí)，被滅菌物品應(yīng)有適當(dāng)?shù)难b載方式，并通過溫度時(shí)間得出F0值，即為相應(yīng)滅菌參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)儀器

脈動(dòng)蒸汽滅菌柜，設(shè)備編號101372FTC02，設(shè)備容積4 m3，滅菌空間分上下兩層，上層最多裝載8個(gè)鋁箱，下層最多裝載16個(gè)鋁箱；X2015溫度驗(yàn)證儀（K儀），設(shè)備編號1407024。

1.3 驗(yàn)證儀探頭布點(diǎn)

在滅菌試驗(yàn)中，將21個(gè)鋁箱（編號A～U）按照圖1所示位置進(jìn)行擺放。在各鋁箱中放置探頭K儀（編號1～24）。其中，鋁箱Q和U分別位于門口和排水口，溫度變化較大，故各放置兩個(gè)探頭，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；鋁箱I多放置一個(gè)探頭是因?yàn)樵阱侒w溫度驗(yàn)證時(shí)，探頭數(shù)量需滿足相關(guān)要求；探頭T5和T6為滅菌鍋?zhàn)詭筋^，代表鍋顯溫度。

圖1 鋁箱裝載位置及驗(yàn)證儀探頭布點(diǎn)圖

1.4 試驗(yàn)方法

（1）試驗(yàn)前后對探頭進(jìn)行校準(zhǔn)，確保試驗(yàn)期間檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。

（2）進(jìn)行熱分布試驗(yàn)：根據(jù)探頭得到的F0值，找到高壓滅菌柜在滅菌時(shí)的冷熱點(diǎn)，避開冷點(diǎn)對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，避免鍋內(nèi)冷熱點(diǎn)對培養(yǎng)基滅菌不到位和滅菌過剩，保證培養(yǎng)基的最佳狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 第一次試驗(yàn)

操作：按照圖1進(jìn)行裝載，滅菌鍋置換30 min后，在115 ℃下滅菌30 min，全過程無手動(dòng)行為。

效果：升溫時(shí)間17 min，排汽22 min，冷卻時(shí)間45 min，F(xiàn)0值12.8；超出平時(shí)滅菌升溫（33 min）、排汽（12 min）和冷卻（10 min）時(shí)間，F(xiàn)0值9.9，滅菌總時(shí)長超出60 min。監(jiān)測冷點(diǎn)為E號箱、R號箱，高點(diǎn)為U號箱。

改善方法：將T5放到E號箱，T6放到R號箱，用手動(dòng)控制升溫（最好在5 min之內(nèi)）和降溫冷卻時(shí)間。

2.2 第二次試驗(yàn)

操作：滅菌鍋置換30 min，115 ℃下滅菌30 min，根據(jù)第一次試驗(yàn)后提出的改善方法操作。

效果：高點(diǎn)U號箱，冷點(diǎn)C號箱，上下層溫度上磅前差3 ℃，上磅后差1 ℃。上層滅菌效果好于下層；T5放到E號箱，T6放在R號箱，手動(dòng)控制升溫5 min到達(dá)115 ℃。但降溫冷卻時(shí)間仍高于平時(shí)30 min，不利于靈敏度提高；鍋顯和K儀的最終F0值最高為15.23，最低為9.45。

改善方法：將T5、T6放在一個(gè)培養(yǎng)基瓶中，放在C號箱附近，接近于平時(shí)滅菌培養(yǎng)基狀態(tài)（不放在鋁箱中），繼續(xù)手動(dòng)控制，升溫控制在5 min左右，查看可否縮短降溫冷卻時(shí)間。

2.3 第三次試驗(yàn)

操作：滅菌鍋置換30 min，115 ℃下滅菌30 min，根據(jù)第二次試驗(yàn)后提出的改善方法操作。

效果：開始滅菌K儀溫度23～25 ℃，T5、T6為25 ℃；此次冷點(diǎn)C號箱，高點(diǎn)U號箱，設(shè)備開始滅菌時(shí)只有O號箱、U號箱達(dá)到115 ℃，但T5、T6探頭不放在箱子中，與培養(yǎng)基溫差為10 ℃；F0值不變后，上層M號箱、R號箱、T號箱的F0值最低；滅菌結(jié)束，排汽冷卻時(shí)間40 min；最終F0值鍋顯為11.1，K儀最高12.7，最低8.2。

改善方法：為了縮小T5、T6探頭與培養(yǎng)基溫差，將T5、T6探頭以及T1探頭放在冷點(diǎn)位置（C號箱），觀察上磅時(shí)T1、T5、T6的溫度差，開門時(shí)T1、T5、T6的溫度差。

2.4 第四次試驗(yàn)

操作：滅菌鍋置換30 min，115 ℃下滅菌30 min，根據(jù)第三次試驗(yàn)后提出的改善方法操作。

效果：T1和T5、T1和T6的溫差基本一致，只有在排汽完成時(shí)溫差為3 ℃。下層溫度比上層低，冷點(diǎn)C號箱，高點(diǎn)U號箱；放到冷點(diǎn)后鍋顯滅菌開始無達(dá)到115 ℃，滅菌5.5 min后U達(dá)到115 ℃，滅菌10 min后U和J到達(dá)115 ℃，滅菌15 min下層T5達(dá)到115 ℃，滅菌20 min平均溫度達(dá)到115 ℃；115 ℃滅菌20 min時(shí)C、F、H、K、P才達(dá)到115 ℃。F0值U號箱最高為10.77，最低C號箱6.51。滅菌結(jié)束至打開鍋門時(shí)間為30 min，解決捂鍋狀態(tài)，但滅菌不徹底。為了達(dá)到滅菌要求，又不影響培養(yǎng)基的靈敏性，可采取以下兩種方法：（1）將T5放在冷點(diǎn)調(diào)整滅菌溫度、時(shí)間；（2）將T5放到與培養(yǎng)基一致狀態(tài)，用T5記錄培養(yǎng)基滅菌狀況，T1控制開門溫度（需要廠家支持）。

改善方法：與第三次狀態(tài)一致的情況下，在118 ℃滅菌30 min。

2.5 第五次試驗(yàn)

操作：滅菌鍋置換30 min，118 ℃下滅菌30 min，T5、T6、K儀10放在冷點(diǎn)位置（C號箱），觀察到達(dá)115 ℃的時(shí)間。

效果：在開始滅菌后，鍋顯達(dá)到118 ℃ 2.5 min后，上層溫度均到達(dá)115 ℃，下層4 min后達(dá)到115 ℃；鍋顯118 ℃ 15 min時(shí)，所有探頭到達(dá)118 ℃；冷點(diǎn)C號箱F0值16.77，高點(diǎn)U號箱F0值22.15，排氣冷卻至開門30 min。經(jīng)過兩次試驗(yàn)證明T5、T6放在冷點(diǎn)排汽到開門時(shí)間最短，避免造成培養(yǎng)基滅菌過剩。

此次試驗(yàn)可造成滅菌過剩，培養(yǎng)基氧化層顏色深。因此，不建議118 ℃下滅菌30 min，可試驗(yàn)116 ℃滅菌30 min或116 ℃滅菌20 min。

改善方法：將T5、T6放在培養(yǎng)基箱中，10號探頭放在冷點(diǎn)（C號箱），115 ℃滅菌30 min。

2.6 第六次試驗(yàn)

操作：滅菌鍋置換30 min，115 ℃下滅菌30 min，將T5、T6放在培養(yǎng)基箱中，T10放在冷點(diǎn)（C號箱），觀察冷點(diǎn)位置與鍋顯溫度（T5、T6）在關(guān)鍵時(shí)刻的溫度差異，結(jié)果如表1所示。

表1 第六次試驗(yàn)關(guān)鍵時(shí)刻的溫度

排汽結(jié)束后冷卻時(shí)段箱內(nèi)箱外溫差加大，箱外降溫急速。F0值最高17.96，最低12.95。排汽到開門70 min。

改善方法：將T5、T6探頭和T3放在冷點(diǎn)（C號箱）空箱中，T10放在C號箱外，看是否可以有效加長培養(yǎng)基真實(shí)滅菌時(shí)間。115 ℃滅菌30 min，觀察T5、T6達(dá)到115 ℃后，培養(yǎng)基各點(diǎn)到達(dá)115 ℃的時(shí)間差。

2.7 第七次試驗(yàn)

操作：滅菌鍋置換30 min，115 ℃下滅菌30 min，根據(jù)第六次試驗(yàn)后提出的改善方法操作，并觀察關(guān)鍵時(shí)刻的溫度差異，結(jié)果如表2所示。

表2 第七次試驗(yàn)關(guān)鍵時(shí)刻的溫度

效果：F0值最低9.65，最高13.51，鍋顯9.0。排汽到開門時(shí)間38 min。開始上磅溫差為3 ℃。上磅10 min后所有探頭溫度達(dá)到115 ℃。總體真實(shí)滅菌溫度達(dá)到115 ℃的時(shí)間有20 min。此次試驗(yàn)數(shù)據(jù)，加長了T5、T6鍋顯探頭和K儀探頭均達(dá)到115 ℃的時(shí)間，且排汽到開門時(shí)間也屬正常范圍，不會造成捂鍋現(xiàn)象。

改善方法：為了加長溫度達(dá)到115 ℃的滅菌時(shí)間，可調(diào)整內(nèi)壓指數(shù)加長10 min的升溫時(shí)間，將升溫時(shí)間控制在13～15 min，讓各點(diǎn)保持溫度一致后，開始上磅。

2.8 第八次試驗(yàn)

操作：滅菌鍋置換30 min，115 ℃下滅菌30 min，將T5、T6和T3放在C號箱空箱中，10號探頭放于C號箱子外，調(diào)整內(nèi)壓指數(shù)加長10 min的升溫時(shí)間，將升溫時(shí)間控制在13～15 min，觀察關(guān)鍵時(shí)刻的溫度差異，結(jié)果如表3所示。

表3 第八次試驗(yàn)關(guān)鍵時(shí)刻的溫度

效果：滅菌6 min后各點(diǎn)溫度已到達(dá)115 ℃，排汽到開門時(shí)間39 min。實(shí)際115 ℃滅菌時(shí)間25 min。

通過以上8次試驗(yàn)，找出滅菌冷點(diǎn)為C號箱、E號箱、K號箱位置，下層溫度比上層溫度升溫慢；最佳滅菌狀態(tài)為滅菌鍋置換30 min，115 ℃下滅菌30 min，將T5、T6置于冷點(diǎn)空箱中，調(diào)整內(nèi)壓指數(shù)加長10 min的升溫時(shí)間，將升溫時(shí)間控制在13～15 min。后續(xù)需要近一步驗(yàn)證滅菌效果，進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)控點(diǎn)送樣試驗(yàn)。

根據(jù)上述要求進(jìn)行滅菌，取6個(gè)點(diǎn)位已滅菌培養(yǎng)基進(jìn)行硫乙適用性（細(xì)菌靈敏度）檢定，檢定結(jié)果合格。

3 結(jié)論

對同一滅菌設(shè)備設(shè)定相同的滅菌程序，滅菌物品在鍋中的碼放位置、碼放狀態(tài)對滅菌效果影響較大，且每臺設(shè)備冷點(diǎn)、熱點(diǎn)位置不一定相同。為保證滅菌效果，進(jìn)行滅菌工藝的開發(fā)、滅菌工藝的驗(yàn)證以及日常監(jiān)控尤為重要。