張濤

（中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 211198）

顆粒酶（GZMs）是絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞家族，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有5種人類顆粒酶（A、B、H、K和M）和11種小鼠顆粒酶。人類顆粒酶基因分別位于3組染色體，其DNA同源性在57%～61%[1]。這些顆粒酶不僅可以在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和自然殺傷細(xì)胞（NK）中表達(dá)，在嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中也有表達(dá)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒酶B在膀胱癌中表達(dá)，影響樣本的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲能力[3]；顆粒酶M在白血病細(xì)胞和實(shí)體瘤細(xì)胞系（Hela）中表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]；顆粒酶A在CTL和NK細(xì)胞中表達(dá)，主要介導(dǎo)穿孔素依賴的細(xì)胞毒性作用，該途徑通過將細(xì)胞毒性顆粒的內(nèi)容物遞送至靶細(xì)胞表面來發(fā)揮作用。盡管已經(jīng)對(duì)淋巴細(xì)胞中顆粒酶A介導(dǎo)的細(xì)胞死亡進(jìn)行了深入研究，但近年來的相關(guān)研究也表明了顆粒酶A可以在卵巢顆粒細(xì)胞等非淋巴細(xì)胞中表達(dá)[5]，具有區(qū)別于細(xì)胞毒性的其他作用。

1 顆粒酶A概述

顆粒酶A是細(xì)胞中含量最多的一種顆粒酶，人們對(duì)其的表達(dá)加工、晶體結(jié)構(gòu)和底物特異性等已經(jīng)有了較為清晰的了解。人顆粒酶A基因位于人類的第5號(hào)染色體5q11～q12處，表達(dá)的顆粒酶A有α和β兩種亞型，α亞型由262個(gè)氨基酸組成，分子量為29 kD，前26個(gè)氨基酸為N端信號(hào)肽，第27和28個(gè)氨基酸為活化肽[6]；β亞型由245個(gè)氨基酸組成，分子量為27 kD。顆粒酶A的特異性主要取決于4個(gè)位點(diǎn)的氨基酸，即Leu217、Glu218、Asn219-A和Gly226[7]，在蛋白精氨酸（Arg）或賴氨酸（Lys）位點(diǎn)后裂解底物。與顆粒酶B不同，顆粒酶A以含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）非依賴的方式殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。

2 顆粒酶A的表達(dá)

顆粒酶的表達(dá)通常僅限于淋巴譜系的細(xì)胞，CTL和NK是已知的組成性合成和存儲(chǔ)顆粒酶的免疫細(xì)胞。顆粒酶在嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中也表達(dá)，但此類細(xì)胞可能需要刺激才可誘導(dǎo)表達(dá)。CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞中合成加工后的顆粒酶被儲(chǔ)存在pH為5.5的分泌性顆粒（SGs）中[8]，確保其在殺傷細(xì)胞內(nèi)沒有活性，以保護(hù)其不破壞宿主細(xì)胞。

近年來的研究表明，在某些形式的刺激下，顆粒酶也可以在非淋巴細(xì)胞中表達(dá)。受到卵泡刺激素的刺激后，卵巢顆粒細(xì)胞中的顆粒酶A表達(dá)上調(diào)。在IL-3刺激的嗜堿性粒細(xì)胞和IgE激活的體外肥大細(xì)胞、紫外線A和紫外線B照射的角質(zhì)形成細(xì)胞以及人的胎盤和睪丸支持細(xì)胞中均檢測(cè)到顆粒酶B的mRNA[9]。有實(shí)驗(yàn)表明，顆粒酶甚至在多種腫瘤細(xì)胞中有所表達(dá)，如顆粒酶B在乳腺癌、肺癌、尿路上皮癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌中均有表達(dá)；顆粒酶M在白血病細(xì)胞和實(shí)體瘤細(xì)胞系（Hela）中表達(dá)。顆粒酶A在乳腺癌細(xì)胞中切割了SET蛋白以及PARP-1蛋白，推測(cè)腫瘤細(xì)胞可能微量表達(dá)顆粒酶A，但這一推測(cè)還有待試驗(yàn)驗(yàn)證。

3 顆粒酶A的激活與抑制

與其他絲氨酸蛋白酶相似，顆粒酶的加工通過兩步過程激活，所有的顆粒酶最初都被合成為無活性的前體分子。（1）根據(jù)顆粒酶A前體分子上的前導(dǎo)序列將前體分子運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，除去前導(dǎo)序列，保留該蛋白氨基末端的一個(gè)二肽[10]。（2）無活性的顆粒酶A被運(yùn)送至分泌性顆粒中經(jīng)二肽基肽酶I（DPPI）裂解二肽轉(zhuǎn)化成有活性的顆粒酶A。DPPI又稱組織蛋白酶C，負(fù)責(zé)在顆粒酶A的激活過程中裂解二肽，是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶超家族。研究發(fā)現(xiàn)，DPPI在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括鱗癌、胰腺癌和乳腺癌[11]。

顆粒酶蛋白水解活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員的調(diào)節(jié)。絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpins）是一個(gè)大的蛋白酶抑制劑家族，可以通過共價(jià)不可逆的方式結(jié)合到酶活性位點(diǎn)上，或者通過形成非常緊密的非共價(jià)復(fù)合物來使其靶向失活。絲氨酸蛋白酶抑制劑B12（Serpin B12）是人類細(xì)胞內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶抑制劑之一[12]，也是顆粒酶A的緩慢結(jié)合抑制劑，該機(jī)制依賴于Serpin B12結(jié)構(gòu)中RSL（Reactive-Site Loop）反應(yīng)中心的Arg和絲氨酸（Ser），顆粒酶A在Arg和Ser位點(diǎn)后切割RSL，使得Serpin B12折疊的張力減弱，導(dǎo)致主要的構(gòu)象發(fā)生重排，進(jìn)而使得顆粒酶A活性位點(diǎn)被扭曲，并將其困在與抑制劑共價(jià)的復(fù)合物中。

此外，顆粒酶A被兩種胰蛋白酶抑制劑α-2巨球蛋白和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合并不可逆地抑制。第3種顆粒酶A抑制劑是胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑（PSTI）[13]，在患有炎癥和組織破壞的患者血液中被發(fā)現(xiàn)。整體上來看，主要是在CTL細(xì)胞和多種靶標(biāo)細(xì)胞中鑒定了顆粒酶A的抑制劑，鑒定其在表達(dá)顆粒酶的腫瘤細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞中的表達(dá)需要盡早完成。

4 顆粒酶A在腫瘤細(xì)胞中潛在的生理功能

研究表明，腫瘤細(xì)胞中有各種蛋白酶的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、組織蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）等己經(jīng)被證明在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。這些蛋白酶類參與了腫瘤對(duì)基底膜的降解并促進(jìn)了腫瘤從原發(fā)部位的脫離進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但關(guān)于顆粒酶在非淋巴細(xì)胞內(nèi)和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的研究并不多，對(duì)于其功能的探討更是少之又少。目前，對(duì)于顆粒酶A的功能研究，主要集中于其在淋巴細(xì)胞中表達(dá)所具有的細(xì)胞毒性作用以及可能的促炎作用。顆粒酶A通過對(duì)NDUFS3、SET復(fù)合物組成部分等底物的切割，誘導(dǎo)染色體DNA產(chǎn)生不可修復(fù)的損傷，最終導(dǎo)致靶標(biāo)細(xì)胞死亡[14]。淋巴細(xì)胞表達(dá)顆粒酶A時(shí)，顆粒酶A底物非常豐富且具有特異性，對(duì)底物的切割是顆粒酶發(fā)揮作用的主要機(jī)制。在核內(nèi)其可以裂解SET復(fù)合物中的多種組分，如核小體組裝蛋白、剪切相關(guān)蛋白、多種轉(zhuǎn)錄因子以及組蛋白。

4.1 與腫瘤遷移相關(guān)

顆粒酶A在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)可能與腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和侵襲遷移有關(guān)。2010年，Donatella等[3]發(fā)現(xiàn)膀胱癌中表達(dá)的顆粒酶B與樣本的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，而且能促進(jìn)尿道癌細(xì)胞的侵襲能力。另外，2015年有研究表明顆粒酶M在白血病細(xì)胞和實(shí)體瘤細(xì)胞系（Hela）中表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并與STAT3的激活相關(guān)[4]。

Gomes等人[15]對(duì)乳腺癌等腫瘤的最新研究表明，在腫瘤發(fā)生過程中，組蛋白變體H3.3作為腫瘤細(xì)胞命運(yùn)的主要調(diào)節(jié)因子被整合到染色質(zhì)中，誘導(dǎo)促轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄重編程，是腫瘤進(jìn)展和侵襲中至關(guān)重要的組分。有研究表明，在星狀孢子素誘導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞（Raji細(xì)胞）死亡過程中，組蛋白H3在體內(nèi)被顆粒酶A裂解[16]。組蛋白變體H3.3作為顆粒酶A的底物，則可能在這一過程中被調(diào)節(jié)，從而影響腫瘤的進(jìn)程和侵襲表型。SET是一種參與多種細(xì)胞過程的多功能癌蛋白，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。NM23H1是一種DNA酶和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，而SET能夠與NM23H1結(jié)合，并抑制其活性。SET的蛋白水解或拮抗將逆轉(zhuǎn)對(duì)NM23H1的抑制，所以顆粒酶A對(duì)于SET的切割同樣可能影響腫瘤的遷移。

4.2 影響腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)

組蛋白是細(xì)胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì)，和DNA共同組成核小體結(jié)構(gòu)，是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)組分，并在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮非常重要的作用。顆粒酶A的眾多底物中則包括組蛋白H1、H2B、H3和H4，其中顆粒酶A對(duì)組蛋白H3和H4的切割也已經(jīng)在Raji細(xì)胞中被證實(shí)[17]。顆粒酶A對(duì)組蛋白的切割通常被認(rèn)為是誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的機(jī)制，但其在腫瘤細(xì)胞中所扮演的角色可能并非僅僅如此。顆粒酶A對(duì)組蛋白底物的切割可能會(huì)改變?nèi)旧|(zhì)的開放狀態(tài)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)調(diào)控。

顆粒酶A對(duì)于SET復(fù)合物的切割是顆粒酶A介導(dǎo)caspase非依賴的凋亡途徑的主要機(jī)制，這一過程涉及眾多底物，包括SET復(fù)合物的組成成分SET、pp32、Ape1和參與SET復(fù)合物組裝和轉(zhuǎn)錄激活的HMG2等。SET同時(shí)也是激素受體介導(dǎo)的基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑，與糖皮質(zhì)激素受體（GR）、甲狀腺激素受體（TR）和雌激素受體（ER）相互作用。此外，核小體組裝蛋白、剪切相關(guān)蛋白以及多種轉(zhuǎn)錄因子等眾多參與基因表達(dá)的蛋白都是顆粒酶A的底物?；谝陨险J(rèn)識(shí)，可以推測(cè)如果腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顆粒酶A，很可能通過對(duì)眾多影響基因表達(dá)來調(diào)控底物的切割，從而影響腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的情況。

4.3 增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性作用的耐受性

腫瘤免疫編輯這一理論認(rèn)為，免疫系統(tǒng)能夠在某個(gè)階段清除異常的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。顆粒酶A介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用能夠靶向轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞中微量表達(dá)顆粒酶A可能有助于其對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用的耐受，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，并且這一過程可能是通過腫瘤細(xì)胞提高顆粒酶A的蛋白酶抑制劑的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞會(huì)通過表達(dá)蛋白酶抑制因子-9來保護(hù)其免受顆粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，作為一種免疫逃避機(jī)制，這一功能隨著肺癌分期的增加而增強(qiáng)[18]。

5 結(jié)語

以往認(rèn)為顆粒酶由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，且所有種類顆粒酶主要是參與細(xì)胞毒性作用以及促炎作用，作為免疫細(xì)胞的子彈來殺傷靶細(xì)胞?；陬w粒酶B以及顆粒酶M腫瘤細(xì)胞中表達(dá)并影響腫瘤進(jìn)程的研究，提出了腫瘤細(xì)胞可能表達(dá)微量顆粒酶A的觀點(diǎn)。對(duì)現(xiàn)有顆粒酶A的研究進(jìn)行了總結(jié)，提出腫瘤細(xì)胞中微量表達(dá)的顆粒酶A可能通過調(diào)控基因表達(dá)和對(duì)底物蛋白的切割影響腫瘤細(xì)胞的遷移、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性作用的耐受性并影響腫瘤進(jìn)程最終促進(jìn)腫瘤逃逸。本文為今后顆粒酶A的研究提供了全新的思路，對(duì)于腫瘤中顆粒酶A作用和機(jī)制的研究也可為今后腫瘤的治療提供新的觀點(diǎn)和干預(yù)策略。