楊紅軍，徐丹萍，胡佳萌，卓志航, 3*，陳 彧

1 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 四川 南充 637002; 2 海南大學(xué)林學(xué)院, 海南 ?？?570228; 3 農(nóng)業(yè)部華南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510642; 4 海南省林業(yè)科學(xué)研究院(海南省紅樹(shù)林研究院), 海南 ?？?571100

象甲科Curculionidae是鞘翅目Coleoptera中最大的科，也是動(dòng)物界中物種數(shù)量最豐富的科，目前全世界記錄有超過(guò)5萬(wàn)種象甲科昆蟲(chóng)，其中我國(guó)超過(guò)1200種(楊毅等，2012)。然而，象甲科昆蟲(chóng)作為害蟲(chóng)時(shí)，由于其具有鉆蛀性、隱蔽性等特點(diǎn)，防治效果往往不佳(李成教，2013)。隨著高通量測(cè)序平臺(tái)的發(fā)展，獲取細(xì)胞過(guò)程的生物學(xué)視角已成為現(xiàn)實(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，可以有效地識(shí)別生物中特定時(shí)空的基因表達(dá)模式(Ozsolak & Milos，2011)。目前，二代高通量測(cè)序分析已廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)學(xué)研究，如揭示各種生物學(xué)現(xiàn)象、基因挖掘以及基因表達(dá)譜構(gòu)建等(許佳丹等，2019)。此外，轉(zhuǎn)錄組也常用于識(shí)別RNA干擾(RNA interference)目標(biāo)，進(jìn)而為害蟲(chóng)控制提供策略(Wangetal.，2011)。綜上，通過(guò)對(duì)象甲科昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入剖析，準(zhǔn)確鑒定相關(guān)靶向基因，可在理論上為象甲科昆蟲(chóng)免疫、生長(zhǎng)發(fā)育、抗藥性等方面的研究奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)而為探究昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組在害蟲(chóng)防治中的作用提供新思路。

本文通過(guò)對(duì)象甲科昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組的淺析，旨在探索細(xì)胞表達(dá)與調(diào)控之間的聯(lián)系，為進(jìn)一步揭示象甲科昆蟲(chóng)的遺傳發(fā)育、免疫、潛在RNA干擾靶點(diǎn)篩選等方面提供參考依據(jù)，也為害蟲(chóng)分子生物學(xué)研究和防治提供新的策略與思路。

1 象甲科昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組研究概述

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，非模式生物的基因挖掘速度和效率顯著提高。許多與昆蟲(chóng)組織(Keelingetal.，2016)和殺蟲(chóng)劑相關(guān)的基因(如殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)、解毒酶和代謝)(Heetal.，2012; Zimmeretal.，2014)已在多種象甲科昆蟲(chóng)中通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行了鑒定。轉(zhuǎn)錄組還可用于推斷與象甲科昆蟲(chóng)機(jī)體發(fā)育及其他進(jìn)化過(guò)程相關(guān)的信息。Keelingetal.(2013a)首次對(duì)象甲科昆蟲(chóng)山松甲蟲(chóng)DendroctonusponderosaeHopkins進(jìn)行了基因組報(bào)道，此項(xiàng)研究給其他象甲科物種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供了依據(jù)。之后,轉(zhuǎn)錄組學(xué)在象甲科多個(gè)方面均取得一些重要進(jìn)展，但主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育差異、觸角分析、與植物互作、昆蟲(chóng)防治、進(jìn)化、RNAi、免疫7個(gè)方面，測(cè)序平臺(tái)主要涉及Illumina HiSeq 2000、羅氏454 FLX Titanium以及PacBio Iso-Seq等。

2 轉(zhuǎn)錄組在象甲科昆蟲(chóng)上的應(yīng)用

2.1 象甲科昆蟲(chóng)不同發(fā)育階段基因的差異分析

深入了解調(diào)節(jié)象甲科昆蟲(chóng)生命周期和發(fā)育各階段的分子機(jī)制，將有助于開(kāi)發(fā)更容易獲得和環(huán)境相契合的方法來(lái)控制害蟲(chóng)。轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果將為多種象甲科害蟲(chóng)的研究提供豐富的分子資源，并為理解象甲科昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)水平的變化提供框架，同時(shí)，該轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)也將闡明昆蟲(chóng)發(fā)育的分子機(jī)理。如，Yangetal.(2020)首次利用PacBio Iso-Seq和Illumina RNA-seq對(duì)紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus(Oliver)的3個(gè)發(fā)育階段(蛹、幼蟲(chóng)、雌性和雄性成蟲(chóng))進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共生成63801個(gè)非冗余的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度2964 bp。Wangetal.(2012)利用Roche/454 GS FLX平臺(tái)捕獲了紅棕象甲不同發(fā)育階段的500萬(wàn)條測(cè)序reads，同時(shí)經(jīng)基因表達(dá)分析顯示，蛹期表達(dá)量最高，幼蟲(chóng)期表達(dá)量最低。此外，該研究還鑒定了超過(guò)60000個(gè)單核苷酸多態(tài)性和1200個(gè)簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記。Yinetal.(2015)對(duì)紅棕象甲的胚胎發(fā)生系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，報(bào)道了該蟲(chóng)5個(gè)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組，包括4個(gè)胚胎階段和1個(gè)幼蟲(chóng)階段，共收集了22532個(gè)在不同胚胎階段表達(dá)的基因；該研究還分析了幾種保守信號(hào)通路(如Hedgehog、JAK-STAT、Notch、TGF-、Ras/MAPK和Wnt)的表達(dá)動(dòng)態(tài)，以及與細(xì)胞凋亡、神經(jīng)發(fā)生和分割相關(guān)的關(guān)鍵發(fā)育基因。另外，Antonyetal.(2017)通過(guò)分析紅棕象甲腸道特異性和不同發(fā)育階段的特異性差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)紅棕象甲在成蟲(chóng)期纖維素酶和果膠酶顯著上調(diào)，半纖維素酶RferGH16c4170特異性高表達(dá)，表明紅棕象甲的植物細(xì)胞壁降解酶的潛力較大。

此外，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)來(lái)篩選不同發(fā)育階段的表達(dá)基因，有助于研究和挖掘昆蟲(chóng)免疫及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵基因。Liu & Wen(2016)利用Roche 454 FLX Titanium平臺(tái)獲得不同發(fā)育階段的溝眶象Eucryptorrhynchuschinensis(Oliver)(卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng))轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)了294條涉及生長(zhǎng)、繁殖和應(yīng)激或免疫反應(yīng)的生化途徑，并檢測(cè)到659026個(gè)單核苷酸變異、6112個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列。Yangetal.(2017)通過(guò)構(gòu)建長(zhǎng)足大竹象CyrtotrachelusbuquetiGuer從卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)的發(fā)育轉(zhuǎn)錄組，獲得了高質(zhì)量的綜合序列資源。此外，為了評(píng)估了長(zhǎng)足大竹象降解竹子木質(zhì)纖維素的能力，探索該蟲(chóng)利用竹子生物量的潛在途徑，Luoetal.(2018)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組研究，認(rèn)為長(zhǎng)足大竹象碳水化合物活性酶家族基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)存在差異。相關(guān)研究還表明，長(zhǎng)足大竹象成蟲(chóng)對(duì)纖維素降解更有效，幼蟲(chóng)對(duì)木質(zhì)素降解更有效，并且降解能力在腸道的不同部位也存在差異，中腸對(duì)纖維素的降解作用強(qiáng)于后腸，且長(zhǎng)足大竹象的腸內(nèi)消化酶在體內(nèi)和體外均可降解竹筍木質(zhì)纖維素(Luoetal.，2018，2019)。Noriegaetal.(2019)通過(guò)Illumina Hiseq平臺(tái)對(duì)咖啡果小蠹Hypothenemushampei(Ferrari)2個(gè)發(fā)育階段(幼蟲(chóng)、雌性和雄性成蟲(chóng))轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序并重新組裝，發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)育階段中4664個(gè)轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)差異表達(dá)。另外，Panditaetal.(2018)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，鑒定了大松象甲HylobiusabietisL.編碼神經(jīng)肽、肽激素以及推定的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的基因，進(jìn)一步闡述了神經(jīng)肽調(diào)節(jié)的過(guò)程。綜上，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究取得極大進(jìn)步，為全方位揭示昆蟲(chóng)學(xué)相關(guān)研究提供了技術(shù)支撐。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段象甲科昆蟲(chóng)基因表達(dá)水平的評(píng)估，將為象甲科昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的研究提供分子基礎(chǔ)。

2.2 象甲科昆蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組分析

象甲科昆蟲(chóng)觸角是感受外界環(huán)境的重要器官，能夠感知信息素、二氧化碳及水分等環(huán)境因子，而象甲通過(guò)識(shí)別不同環(huán)境因子，進(jìn)一步產(chǎn)生取食、交配、產(chǎn)卵等行為。近幾年，轉(zhuǎn)錄組在象甲科昆蟲(chóng)觸角的研究發(fā)展迅速，這對(duì)昆蟲(chóng)化學(xué)生態(tài)學(xué)及行為學(xué)等研究有重要意義。例如，Anderssonetal.(2013)通過(guò)對(duì)云杉樹(shù)皮甲蟲(chóng)IpstypographusL.與山松甲蟲(chóng)的觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了與嗅覺(jué)功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本；針對(duì)化學(xué)感覺(jué)基因家族，從云杉樹(shù)皮甲蟲(chóng)中鑒定了15個(gè)氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBP)、6個(gè)化學(xué)感覺(jué)蛋白(chemosensory proteins，CSP)、6個(gè)味覺(jué)受體(gustatory receptors，GR)、3個(gè)感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMP)、7個(gè)離子性受體(ionotropic receptors，IR)和43個(gè)氣味受體(odorant receptors，OR)；在山松甲蟲(chóng)中鑒定了31個(gè)OBPs、11個(gè)CSPs、3個(gè)SNMPs、49個(gè)ORs、2個(gè)GRs、15個(gè)IRs。Keelingetal.(2013b)分析了山松甲蟲(chóng)觸角的細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)DponCYP345E2轉(zhuǎn)錄本功能表征，結(jié)果表明，細(xì)胞色素P450在山松甲蟲(chóng)嗅覺(jué)、萜烯解毒和信息素生物合成中發(fā)揮作用。Chiuetal.(2018)在山松甲蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中也發(fā)現(xiàn)了大量的P450，且對(duì)雌性和雄性山松甲蟲(chóng)不同生命階段和組織的轉(zhuǎn)錄水平分析顯示，P450s在中腸或脂肪體中有額外表達(dá)。更重要的是，山松甲蟲(chóng)可以使用P450s來(lái)解毒松樹(shù)防御系統(tǒng)中的其他單萜烯(Chiuetal.，2019)。與此同時(shí)，陸續(xù)分析了大量象甲科昆蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組，如紅棕象甲(Yanetal.，2015)、紅脂大小蠹DendroctonusvalensLeConte(Guetal.，2015)、稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel(Yuanetal.，2016；Zhangetal.，2019)、甘薯象蟲(chóng)CylasformicariusFabr.(Binetal.，2017)、玉米象甲Sitophiluszeamais(Motchulsky)(Tangetal.，2019a，2019b)、棉鈴象甲AnthonomusgrandisBoheman(Paulaetal.，2018)等。綜上，對(duì)象甲科昆蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組的分析將會(huì)發(fā)掘大量的具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因，特別是氣味識(shí)別、傳導(dǎo)及降解相關(guān)的基因，這些基因?qū)橄蠹卓朴|角基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

2.3 象甲科昆蟲(chóng)與植物互作的研究

由于寄主植物通常具有多種防御機(jī)制，象甲科昆蟲(chóng)對(duì)寄主的選擇和隨后的成功定殖充滿了不確定性。寄主植物通常含有大量潛在毒性的特殊代謝物，象甲科昆蟲(chóng)必須忍受這些代謝物或具有解毒能力才能成功生存和繁殖(Keeling & Bohlmann,2006)，而轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析(RNA-seq)能夠有效解釋象甲科昆蟲(chóng)的解毒機(jī)理以及寄主植物的免疫應(yīng)答機(jī)制。Robertetal.(2013)鑒定了山松甲蟲(chóng)在寄主定殖早期與其解毒有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，該研究表明，在以寄主組織為食的昆蟲(chóng)中，發(fā)揮潛在解毒作用的轉(zhuǎn)錄本為醇脫氫酶。Pittetal.(2014)建立了山松甲蟲(chóng)在寄主定殖的蛋白質(zhì)組圖譜，并在對(duì)雌蟲(chóng)與雄蟲(chóng)進(jìn)行蛋白質(zhì)組監(jiān)測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雌蟲(chóng)發(fā)生了重大且快速的生理變化，該變化在伴隨蛋白(chaperone proteins)、細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)具有大量積累，表明次級(jí)代謝物誘導(dǎo)的應(yīng)激生理與早期寄主定殖過(guò)程中的化學(xué)排毒有關(guān)；該研究還發(fā)現(xiàn)，山松甲蟲(chóng)雌蟲(chóng)只有在遇到宿主后才激活卵黃蛋白原，這一現(xiàn)象表明資源的分配和分散與繁殖相關(guān)。雖然山松甲蟲(chóng)的信息素生物合成途徑所涉及的酶還沒(méi)有全部被識(shí)別或鑒定出來(lái)，但Nadeauetal.(2017)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)鑒定了一種細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP6DE3，并確定了其功能特征是參與樹(shù)脂解毒而非信息素生物合成。

植物在受到昆蟲(chóng)危害后，會(huì)改變其防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。如Articoetal.(2014)利用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)對(duì)受棉鈴象甲幼蟲(chóng)感染的棉花轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，大量棉花的轉(zhuǎn)錄本在幼蟲(chóng)取食后發(fā)生顯著改變，且在基因表達(dá)的變化中，該研究識(shí)別了幾丁質(zhì)或昆蟲(chóng)口腔分泌物的受體/傳感器的轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子Ca2+和活性氧有關(guān)以及編碼植物激素信號(hào)通路的酶轉(zhuǎn)錄物調(diào)控發(fā)生了改變。Giovinoetal.(2015)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析了紅棕象甲對(duì)加拿利海棗PhoenixcanariensisChabaud攻擊的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該研究發(fā)現(xiàn)，在攻擊的中間階段共有54個(gè)基因發(fā)生顯著變化，且途徑富集分析表明，此階段誘導(dǎo)了與苯丙烷相關(guān)的途徑；而在攻擊后期，超過(guò)3300個(gè)基因受到了影響，其中脂質(zhì)脂肪酸代謝(脂肪酸和甘油脂)、色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝的轉(zhuǎn)錄本豐度更高。綜上，轉(zhuǎn)錄組在象甲科昆蟲(chóng)與植物互作方面，特別是解毒機(jī)理與代謝機(jī)制的研究，將為象甲科昆蟲(chóng)的可持續(xù)治理提供參考依據(jù)。

2.4 象甲科昆蟲(chóng)防治的研究

為了更好地了解異源化合物的殺蟲(chóng)機(jī)理，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)廣泛運(yùn)用于殺蟲(chóng)劑施用對(duì)象甲科昆蟲(chóng)酶活性影響的研究(Francisetal.，2010)。此外，相關(guān)研究也證實(shí)，象甲科昆蟲(chóng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在各種應(yīng)激源中起重要作用(Chenetal.，2016)。例如，Liaoetal.(2016)通過(guò)分析互生葉白千層MelaleucaalternifoliaL.葉油處理后的玉米象甲Sitophilusoryzae(L.)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定出3562個(gè)差異表達(dá)基因，其中大部分的差異表達(dá)基因參與了殺蟲(chóng)劑解毒和線粒體功能，這為開(kāi)發(fā)新型且對(duì)環(huán)境友好的植物精油害蟲(chóng)熏蒸劑奠定了良好的基礎(chǔ)。Zhangetal.(2017)利用異硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate)熏蒸玉米象甲，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)定并分析差異基因表達(dá)，結(jié)果表明,細(xì)胞骨架崩潰和線粒體功能障礙是異硫氰酸烯丙酯的重要致死機(jī)制。Huangetal.(2018)使用RNA-seq方法評(píng)估了二烯醇(terpmen-4-ol)熏蒸玉米象甲的整體基因表達(dá)情況，結(jié)果表明,玉米象甲解毒基因尤其是P450s的表達(dá)水平發(fā)生了改變，這為研究象甲科昆蟲(chóng)對(duì)二烯醇的全身代謝反應(yīng)提供了候選基因。綜上，利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)象甲科昆蟲(chóng)的防治研究將為其生態(tài)可持續(xù)防治提供新思路。

2.5 象甲科昆蟲(chóng)免疫機(jī)制的研究

為適應(yīng)外界環(huán)境，節(jié)肢動(dòng)物(如昆蟲(chóng))已進(jìn)化出多種解毒機(jī)制，進(jìn)而減少病原對(duì)個(gè)體的毒性作用，從而達(dá)到免疫的目的(蒲宇辰等,2017)。在轉(zhuǎn)錄組水平上加強(qiáng)對(duì)象甲科昆蟲(chóng)和外源刺激之間免疫相互作用的研究，將為今后的昆蟲(chóng)學(xué)研究提供豐富的免疫遺傳學(xué)信息。Xuetal.(2018)通過(guò)鑒定紅脂大小蠹在不同病原菌下的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌Beauveriabassiana比吐溫菌Leptographiumprocerum(Kendr)能有效地殺滅大多數(shù)供試幼蟲(chóng)，研究還表明，昆蟲(chóng)病原真菌能在轉(zhuǎn)錄組水平上比共生真菌引起更強(qiáng)的響應(yīng)；同時(shí)，該研究還鑒定了185個(gè)免疫相關(guān)基因，包括模式識(shí)別受體、信號(hào)調(diào)節(jié)因子、免疫通路成員(Toll、IMD和JAK/STAT)和免疫效應(yīng)因子等。轉(zhuǎn)錄組與生理實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的研究證實(shí)，與無(wú)菌環(huán)境的昆蟲(chóng)相比，傳統(tǒng)飼養(yǎng)的昆蟲(chóng)具有更強(qiáng)的抗菌活性和更高的酚氧化酶活性，說(shuō)明無(wú)菌昆蟲(chóng)的系統(tǒng)免疫應(yīng)答明顯受損，相關(guān)研究結(jié)果還揭示了腸道共生菌對(duì)紅棕象甲幼蟲(chóng)具有更強(qiáng)的免疫刺激作用(Muhammadetal.，2019)。Valenciaetal.(2016)通過(guò)羅氏454測(cè)序法對(duì)香蕉象甲Cosmopolitessordidus(Germar)幼蟲(chóng)中腸進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)定，確定了可能涉及免疫相關(guān)功能和殺蟲(chóng)劑抗性的基因。由于先天免疫反應(yīng)是害蟲(chóng)對(duì)抗病原體的唯一途徑，利用腸道菌群影響宿主免疫被認(rèn)為是一種很有前途的害蟲(chóng)防控策略(Muhammadetal.，2019)。在全球環(huán)境變化的情形下，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠高效且經(jīng)濟(jì)地研究昆蟲(chóng)種群變化及其對(duì)農(nóng)業(yè)的破壞情況(Clarketal.，2001)。低溫致死是象甲科昆蟲(chóng)通過(guò)免疫調(diào)控種群數(shù)量的一個(gè)重要方面，而轉(zhuǎn)錄組在其中的應(yīng)用頗為廣泛。Robertetal.(2016)分別對(duì)山松甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)越冬的早秋、晚秋、早春、晚春4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄研究，結(jié)果表明，隨著冬季轉(zhuǎn)錄譜的變化，幼蟲(chóng)產(chǎn)生了多種生理反應(yīng)，其主要特征是在秋季參與昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)和解毒的基因轉(zhuǎn)錄。

象甲科昆蟲(chóng)分泌外部免疫物的轉(zhuǎn)錄組的遺傳和分子機(jī)制也有大量的研究。例如，Puetal.(2020)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選了紅棕象甲苯醌合成所需的基因，分離了3個(gè)新的ARSB基因，即RfARSB-0311、RfARSB-11581和RfARSB-14322，通過(guò)組織/器官特異性表達(dá)譜分析，證實(shí)ARSB基因家族可以通過(guò)參與醌的生物合成來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)苯醌的分泌量，從而改變宿主的外部免疫抑制效率。Gagnonetal.(2019)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組評(píng)估了不同生命階段的胡蘿卜象甲Listronotusoregonensis(LeConte)感染寄生線蟲(chóng)Bradynemalistronoti后繁殖力和死亡率的變化，發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)更易受感染，且被感染的雌性胡蘿卜象甲的繁殖力顯著降低，其原因可能是生殖激素的產(chǎn)生被抑制。綜上，象甲科昆蟲(chóng)免疫機(jī)制的研究，將改善甚至推動(dòng)新的象甲科昆蟲(chóng)控制策略。

2.6 象甲科昆蟲(chóng)進(jìn)化的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠獲得多個(gè)基因片段數(shù)據(jù)并且可以消除單基因信息不足的劣勢(shì)，利用該優(yōu)勢(shì)能重現(xiàn)昆蟲(chóng)的進(jìn)化史并且提供其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的可靠信息(Zouetal.，2008)。此外，植物細(xì)胞壁是地球上最大的有機(jī)碳貯存庫(kù)，為了充分和有效地利用這一富含碳水化合物的巨大資源，微生物進(jìn)化出了先進(jìn)酶解系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以分泌以果膠、纖維素和半纖維素為靶點(diǎn)的植物細(xì)胞壁降解酶，而象甲科昆蟲(chóng)在進(jìn)化方面也有類似的系統(tǒng)。例如，Royetal.(2014)利用轉(zhuǎn)錄組對(duì)10種葉甲總科和象甲科的甲蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，葉甲總科和象甲科均有一個(gè)大家族的PG編碼基因共享一個(gè)共同的祖先，最類似于子囊菌真菌的PG基因；此外，該研究還鑒定了象甲科甲蟲(chóng)消化系統(tǒng)的50個(gè)PG，證實(shí)了象甲科昆蟲(chóng)具有一套特異性連續(xù)的果膠降解酶以及保守但酶活性不高的PG蛋白。研究還發(fā)現(xiàn)，一些食草昆蟲(chóng)的基因組也可以編碼植物細(xì)胞壁降解酶。Neupertetal.(2018)則通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和多肽組學(xué)技術(shù)，分析了大黑甲Zophobasatratus(Fabricius)和棉鈴象甲中的基因產(chǎn)物，結(jié)果表明，即使在具有代表性的一組鞘翅目昆蟲(chóng)中，神經(jīng)肽能系統(tǒng)也發(fā)生了截然不同的進(jìn)化過(guò)程。綜上，轉(zhuǎn)錄組在象甲科昆蟲(chóng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用將為研究其進(jìn)化與起源提供豐富的數(shù)據(jù)資源。

2.7 象甲科基因沉默的應(yīng)用

“轉(zhuǎn)錄組學(xué)”不僅是研究昆蟲(chóng)的分子、遺傳和細(xì)胞的重要工具，也是鑒定和選擇RNAi目標(biāo)基因的重要工具(Zhangetal.，2017a)。如，高特異性RNAi機(jī)制顯示出對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)管理的良好效果(Zhangetal.，2017b)。Garciaetal.(2017)在棉鈴象甲的轉(zhuǎn)錄組中鑒定了3種核酸酶(AgraNuc1、AgraNuc2和AgraNuc3)，并評(píng)估了這些核酸酶對(duì)幾丁質(zhì)合成酶II(AgraChSII)基因沉默的影響，結(jié)果證實(shí)，這些核酸酶主要在后中腸區(qū)表達(dá)，而棉鈴象甲中腸核酸酶是雙鏈核糖核酸dsRNA傳遞的主要障礙之一，因此需要開(kāi)發(fā)新的RNAi傳遞策略，保護(hù)dsRNA不受腸道核酸酶的影響，進(jìn)而有效控制棉鈴象甲。相關(guān)研究也表明，將幾丁質(zhì)合酶基因(AntgCHS1)用dsRNA微注射到棉鈴象甲雌成蟲(chóng)體內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致卵無(wú)法存活和后代幼蟲(chóng)畸形(Firminoetal.，2013)。另外，通過(guò)構(gòu)建OBPs文庫(kù)，選擇具有特異性的高表達(dá)OBPs，通過(guò)RNAi進(jìn)行沉默，也能達(dá)到生態(tài)防治象甲科昆蟲(chóng)的目的。Antonyetal.(2018)發(fā)現(xiàn)，特異性RferOBP1768有助于紅棕象甲捕獲和轉(zhuǎn)運(yùn)氣味受體，當(dāng)負(fù)責(zé)信息素結(jié)合的RferOBP1768被沉默后，信息素的交流將中斷。Hassanetal.(2016)以不同的dsRNA敲除了紅棕象甲5齡和10齡幼蟲(chóng)的過(guò)氧化氫酶基因，結(jié)果紅棕象甲幼蟲(chóng)的死亡率顯著提高并且生長(zhǎng)受到抑制。Francescaetal.(2017)通過(guò)沉默紅棕象甲3種基因(α-淀粉酶、V-ATPase、蛻皮激素受體)評(píng)估死亡率，結(jié)果表明，α-淀粉酶和蛻皮激素受體基因更具開(kāi)發(fā)RNAi靶標(biāo)的潛力，即顯著的害蟲(chóng)死亡率和幼蟲(chóng)生長(zhǎng)抑制作用突顯了使用該技術(shù)對(duì)紅棕象甲種群控制的可能性。綜上，轉(zhuǎn)錄組在象甲科基因沉默研究中的應(yīng)用將為作物保護(hù)提供新的思路。

3 展望

盡管象甲科昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組研究已取得了較多進(jìn)展，但明確象甲科昆蟲(chóng)與植物互作的機(jī)理、免疫機(jī)制等仍需要更深入的研究。因此，基于現(xiàn)有象甲科昆蟲(chóng)的研究現(xiàn)狀及其防治要求，今后象甲科昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)可能體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)在基因組和轉(zhuǎn)錄組資源的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，可以利用第三代測(cè)序平臺(tái)捕獲全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組；與第二代測(cè)序平臺(tái)轉(zhuǎn)錄組相比，全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本可以極大提高基因組注釋和轉(zhuǎn)錄組表征的準(zhǔn)確性(Dongetal.，2015)。同時(shí)，第三代測(cè)序技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、序列讀取長(zhǎng)、偏差程度低等優(yōu)勢(shì)(Robertsetal.，2013)，該優(yōu)勢(shì)將為象甲科昆蟲(chóng)的分子生物學(xué)研究提供更可靠的數(shù)據(jù)支撐。(2)加強(qiáng)多組學(xué)間結(jié)合(如基因組、代謝組、蛋白組等)，利用多組學(xué)對(duì)象甲科昆蟲(chóng)進(jìn)行更全面和更深層次的研究，多組學(xué)的結(jié)合對(duì)基因功能研究更準(zhǔn)確、更快速，如利用RNA干擾技術(shù)與CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)相結(jié)合，將為害蟲(chóng)的高效防治提供更新、更有效的思路(侯麗等，2017)。(3)對(duì)象甲科昆蟲(chóng)開(kāi)展非編碼 RNA的研究，該研究方向已成為昆蟲(chóng)毒理學(xué)研究的一個(gè)新興領(lǐng)域(朱斌等，2016)。與此同時(shí)，非編碼 RNA作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控的新機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)一種內(nèi)源的控制因子，能行使多重功能(薛娟，2012)。隨著轉(zhuǎn)錄技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)昆蟲(chóng)學(xué)在轉(zhuǎn)錄組的研究將會(huì)進(jìn)入更新更全面的階段，該階段將致力于探究和解決更多更重要的科學(xué)問(wèn)題，這些問(wèn)題將不局限于基因的表達(dá)豐度與動(dòng)態(tài)變化，而是更多地涉及基因功能及其作用機(jī)理，進(jìn)而為昆蟲(chóng)遺傳發(fā)育、免疫、潛在RNA干擾靶點(diǎn)篩選等的研究提供參考依據(jù)。