秦銳峰

（河南省平頂山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 平頂山 467000）

郟縣紅牛是中國八大地方優(yōu)良黃牛品種之一，同時也是我國培育肉牛新品種的核心地方品種。

建立牛胚胎基因庫是目前牛保種最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法之一。同期發(fā)情、超數(shù)排卵技術(shù)是建立胚胎基因庫的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)在奶牛、水牛上得以廣泛的應(yīng)用與推廣，應(yīng)用于肉牛的報道也屢見不鮮，不少地方品種如南陽牛、秦川牛、晉南牛的同期發(fā)情與超數(shù)排卵也有報道，而郟縣紅牛至今尚無相關(guān)報道。該研究擬探索有效、穩(wěn)定的郟縣紅牛同期發(fā)情與超排程序，以利于郟縣紅牛胚胎基因庫的建設(shè)，同時也為其他地方品種黃牛的同期發(fā)情與超數(shù)排卵工作提供借鑒和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點、時間

該試驗研究于2018 年2 月至5 月在河南省平頂山市郟縣紅牛繁育中心進(jìn)行。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗動物

純種郟縣紅牛供體母牛10 頭，均為19～27 月齡青年牛，健康，性周期正常，無生殖器官疾病。試驗期間，所有參試牛均舍飼，以青粗飼料配合精料飼喂，膘情適中。

郟縣紅牛特級公牛7頭，采自平頂山市郟縣紅牛繁育中心。

1.2.2 主要儀器、設(shè)備

牛非手術(shù)采胚器械；胚胎冷凍儀；實體顯微鏡。

1.2.3 主要試劑、藥品

氯前列烯醇（PG）0.2 毫克/支；垂體促卵泡素（FSH）400毫克/支；垂體促卵泡素（FSH）10毫克/支。

促排3號；20微克/支；孕激素陰道栓（CIDR）；牛血清白蛋白（BSA）；胎牛血清（FCS）；沖胚液：含1%胎牛血清（FCS）的PBS液；撿胚液：含10%胎牛血清（FCS）的PBS液。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗牛同期發(fā)情處理

1.3.1.1 肌肉注射PG 法 在發(fā)情周期的任一天肌注PG 0.4 毫克/頭，記為第1 天，之后觀察發(fā)情，準(zhǔn)確記錄發(fā)情時間并統(tǒng)計發(fā)情率。

1.3.1.2 CIDR+PG 法 在發(fā)情周期的任一天放置CIDR栓，記為第1 天，第12 天下午撤栓，撤栓的同時肌肉注射PG 0.4毫克/頭，之后觀察發(fā)情，準(zhǔn)確記錄發(fā)情時間并統(tǒng)計發(fā)情率。

1.3.2 試驗牛的超排處理

1.3.2.1 在發(fā)情周期的任一天放置CIDR栓，記為第1 天，第10天開始遞減劑量肌注FSH，每日2次，間隔時間12 h，連續(xù)4 d。第5 次注射FSH 的同時，再肌注氯前列烯醇（PG）0.4毫克/頭。第12天下午撤栓。發(fā)情后輸精3次，第1次、第2次之間間隔8 h，第2次、第3次之間間隔16 h，每次輸2支細(xì)管凍精。

1.3.2.2 不同廠家FSH 的比較 超排方法同上。對郟縣紅牛10 頭供體母牛中的7 頭從第10 天開始連續(xù)4 d 遞減劑量肌肉注射國產(chǎn)FSH（中科院動物所產(chǎn)，規(guī)格10 毫克/支），其余3頭郟縣紅牛供體母牛則注射進(jìn)口FSH（加拿大產(chǎn)，規(guī)格400毫克/支）。

1.3.3 沖胚及撿胚

輸精后6～7 d 進(jìn)行沖胚。沖胚前直腸檢查供體牛的超排反應(yīng)情況，同時記錄左、右側(cè)黃體數(shù)和黃體總數(shù)。使用三通式采胚管進(jìn)行非手術(shù)法沖胚，每側(cè)子宮角各用500 ml沖卵液沖洗7～8 次，子宮回流液靜置后實體顯微鏡下?lián)炫?。統(tǒng)計左、右側(cè)黃體數(shù)、黃體總數(shù)和獲胚數(shù)，應(yīng)用SAS8.0軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 不同同期發(fā)情處理方法對同期發(fā)情效果的影響

不同同期發(fā)情處理方法對郟縣紅牛同期發(fā)情效果的影響結(jié)果表明，PG法處理的同期發(fā)情率為40%，而CIDR+PG法處理的同期發(fā)情率為100%，二者差異顯著（P<0.05）。

2.2 郟縣紅牛總體超排效果比較

郟縣紅?？傮w超排效果表明，應(yīng)用連續(xù)4 d遞減肌注FSH法對郟縣紅牛供體牛進(jìn)行超排處理，獲得頭均黃體數(shù)7.90個，頭均獲胚數(shù)2.80枚。

2.3 進(jìn)口與國產(chǎn)FSH對超排效果的影響

進(jìn)口與國產(chǎn)FSH對供體超排效果的比較結(jié)果表明，采用加拿大進(jìn)口和國內(nèi)中科院動物所生產(chǎn)的FSH進(jìn)行超排，二者獲得的頭均黃體數(shù)分別為14.00 個和5.29 個，差異顯著（P<0.05），頭均獲胚數(shù)分別為2.33 枚和3.00 枚，差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 不同同期發(fā)情處理方法對郟縣紅牛供體母牛同期發(fā)情效果的影響

氯前列烯醇是前列腺素（PG）類似物的一種，具有溶解黃體的作用，但它只對母牛發(fā)情周期5～18 d 的黃體有溶解作用，而對發(fā)情前后3～5 d 則無溶解功能。因此，PG法處理后總有部分母牛無反應(yīng)。何光中等以關(guān)嶺黃牛為研究對象采用PG法處理同期發(fā)情率為60.0%。趙維等用PG 誘導(dǎo)紅安格斯肉牛的同期發(fā)情試驗中，同期發(fā)情率為75.0%。和占星等在對水牛同期發(fā)情的研究中PG法處理供體牛的同期發(fā)情率為43.33%。權(quán)凱等對青海大通牦牛同期發(fā)情應(yīng)用PG法處理的發(fā)情率為41.2%。研究結(jié)果顯示，PG法處理郟縣紅牛同期發(fā)情率為40.0%，這與所選牛群的狀態(tài)及牛群規(guī)模有一定的關(guān)系。

孕酮陰道栓（CIDR）在體內(nèi)持續(xù)分泌孕酮，維持血液中孕酮的高水平，抑制卵泡的生長。當(dāng)同時撤栓后，卵泡生長的抑制因素被解除，為卵泡的生長提供了一個共同的起點，從而達(dá)到同期發(fā)情的目的，但是，有些個體在撤栓時黃體還未退化，這樣在撤栓后黃體繼續(xù)分泌孕酮，達(dá)不到發(fā)情同期化的效果。針對這種情況，在撤栓后肌注PG，從而達(dá)到溶解黃體的目的，在一定程度上提高了同期發(fā)情的效果。據(jù)趙永聚等在山羊上做的同期發(fā)情試驗結(jié)果顯示，用CIDR 法處理，撤栓后直接觀察發(fā)情，同期發(fā)情率為37.5%，而CIDR撤栓后再肌注PG，同期發(fā)情率為93.75%，顯著高于第一種方法。很多試驗證明，CIDR 結(jié)合PG，可獲得理想的同期發(fā)情效果。郭志勤等用CIDR+PG法處理荷斯坦牛，撤栓后同期發(fā)情率達(dá)95%以上。韋英明等用該方法處理水牛也獲得了相似的結(jié)果。該試驗撤栓后再肌注PG，同期發(fā)情率為100%。

應(yīng)用PG 法和CIDR+PG 法對郟縣紅牛進(jìn)行同期發(fā)情處理，同期發(fā)情率分別為40%和100%，兩者差異顯著（P<0.05）。該試驗CIDR+PG 處理法的同期發(fā)情率顯著高于PG法，同期發(fā)情效果明顯且理想。

3.2 郟縣紅牛超數(shù)排卵研究

該試驗共有效超排郟縣紅牛供體牛10 頭次，獲得頭均黃體總數(shù)7.90 個，頭均獲胚數(shù)2.80 枚。說明采用的超排方法處理郟縣紅牛是可行的。前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晉南牛頭均可用胚數(shù)3.94枚、溫嶺高峰黃牛3.04枚、青海黃牛4.00 枚、秦川牛4.20 枚、南陽牛4.28 枚。2.80 枚的頭均獲胚數(shù)與研究結(jié)果相比有一定的差距，原因可能是多方面的。其一可能與該試驗所用牛的地方品種有關(guān)，郟縣紅牛的超排效果可能不如奶牛、水牛及其他地方黃牛品種；其二，本次超排的供體牛全部為青年牛，個體較小，沖卵困難，有部分供體操作受阻或回收液無法撿胚，這些情況可能直接影響沖卵效果，因此，筆者質(zhì)疑郟縣紅牛是繼續(xù)像其他地方品種黃牛那樣選用青年牛進(jìn)行超排，還是選用體格相對較大的經(jīng)產(chǎn)郟縣紅牛進(jìn)行超排；其三，該研究在河南省平頂山市郟縣紅牛繁育中心進(jìn)行，該中心成立于2007 年，由于建成時間短，供體牛多是從散養(yǎng)戶購進(jìn)，背景復(fù)雜，而且繁育中心的飼養(yǎng)管理制度尚未規(guī)范化，導(dǎo)致供體牛的營養(yǎng)狀況不好，可能直接影響超排效果；最后，郟縣紅牛的超數(shù)排卵試驗研究在此之前無人做過，沒有現(xiàn)成的方案可供參考，所有程序都是在參考奶牛、水牛及其他地方品種黃牛超排程序的基礎(chǔ)上所做的探索性試驗研究，因此，很多地方都有待商榷和進(jìn)一步提高。另外，操作人員對沖卵技術(shù)的熟練程度也直接影響超排結(jié)果。

3.3 國產(chǎn)與進(jìn)口FSH對超排效果的影響

現(xiàn)階段國內(nèi)牛超排常用的FSH 有進(jìn)口和國產(chǎn)兩大類。進(jìn)口FSH價格高，但效果和穩(wěn)定性高于國產(chǎn)產(chǎn)品。國產(chǎn)FSH價格低，從成本方面考慮有一定的優(yōu)勢。該試驗研究同時選用加拿大進(jìn)口和國內(nèi)中科院動物所生產(chǎn)的FSH進(jìn)行超排，結(jié)果表明，在對郟縣紅牛超排處理后，進(jìn)口FSH獲得的頭均黃體總數(shù)14.00個與國產(chǎn)FSH5.29個差異顯著（P<0.05），而進(jìn)口FSH的頭均獲胚總數(shù)2.33枚與國產(chǎn)FSH的3.00 枚差異不顯著（P>0.05）。提示進(jìn)口FSH 的超排效果明顯高于國產(chǎn)，但在供體牛狀態(tài)不理想，沖卵技術(shù)不熟練等條件下，考慮到成本因素，可以選用國產(chǎn)藥進(jìn)行超數(shù)排卵。

4 結(jié)論

該研究以郟縣紅牛為研究對象，對其進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵研究，所得同期發(fā)情率為70%；超排處理獲得頭均黃體數(shù)7.90±4.72個，頭均獲胚數(shù)2.80±2.44枚。該研究試圖應(yīng)用同期發(fā)情和超數(shù)排卵技術(shù)建立胚胎基因庫保存郟縣紅牛優(yōu)秀遺傳基因，而這是首次對郟縣紅牛較大規(guī)模的超數(shù)排卵研究。研究發(fā)現(xiàn)，CIDR+PG法處理比PG法處理供體牛的同期發(fā)情效果顯著；對郟縣紅牛應(yīng)用FSH連續(xù)4 d 遞減法肌肉注射進(jìn)行超排是可行的。同時，地方品種的同期發(fā)情與超數(shù)排卵技術(shù)是一項復(fù)雜的工作，其有效、穩(wěn)定的同期發(fā)情與超數(shù)排卵的方法和程序還有待于進(jìn)一步探索?！?/p>