劉 娜，張 敏，張士義，李宏亮，宋 瑩

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

煙色離褶傘（Lyophyllum fumosumy），系傘菌目（Agaricales） 離褶傘科 （Lyophyllaceae） 離褶傘屬（Lyophyllum）真菌[1]。煙色離褶傘在遼寧地區(qū)享譽(yù)盛名，風(fēng)味獨(dú)特，被當(dāng)?shù)匕傩找暈檎淦穂2]。近年來(lái)，由于生境變化和人類活動(dòng)等的影響，野生煙色離褶傘已瀕臨滅絕，而煙色離褶傘的普通溫室人工栽培周期長(zhǎng)，栽培難度很大。目前，人工培育煙色離褶傘的難題是制種和催蕾，其育種期約90 d，催蕾期對(duì)光照、溫度、濕度等要求嚴(yán)格。目前，煙色離褶傘在日光溫室內(nèi)以秸稈、稻草為主料進(jìn)行菌袋碼堆墻式出菇，工序繁瑣，環(huán)境條件無(wú)法精確控制，生物學(xué)效率僅為55%左右[3]。而工廠化栽培煙色離褶傘比自然條件或輔助設(shè)施栽培更能夠準(zhǔn)確控制溫度、濕度、光線、二氧化碳濃度等環(huán)境條件[4]。因此，利用液體菌種為原種，用于工廠化栽培出菇，可使菌種生產(chǎn)周期大幅度縮短。在優(yōu)化液體菌種培養(yǎng)條件的同時(shí)，開(kāi)展了煙色離褶傘工廠化栽培技術(shù)初探，以期為煙色離褶傘工廠化開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

煙色離褶傘菌株，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所遺傳育種研究室提供。原種采自彰武縣四合城鄉(xiāng)，純化后經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定命名為煙色離褶傘。

1.1.2 液體菌種基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方

馬鈴薯20%、葡萄糖2%，蛋白胨0.20%、磷酸二氫鉀0.30%、硫酸鎂0.15%，自來(lái)水定容至1 000 mL。

1.2 液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

設(shè)計(jì)碳源、氮源、外源營(yíng)養(yǎng)、培養(yǎng)溫度4個(gè)液體菌種培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)。除溫度試驗(yàn)外，其余試驗(yàn)均在25℃條件下培養(yǎng)（250 mL三角瓶培養(yǎng)液的裝液量為100 mL，用6 mm打孔器取菌種2塊接入液體培養(yǎng)基），培養(yǎng)8 d時(shí)，通過(guò)測(cè)量菌絲生物量、菌球密度及菌球直徑確定最佳單因素培養(yǎng)條件[5]。

1.2.1 碳源

在每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2.0%的木糖、果糖、海藻糖、蜜糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、山梨醇替代葡萄糖，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基共配成10種碳源培養(yǎng)基。

1.2.2 氮源

在每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0.2%的酪蛋白氨基酸、尿素、酵母膏、氯化銨、牛肉膏、黃豆粉替代蛋白胨，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基共配成7種氮源培養(yǎng)基。

1.2.3 外源營(yíng)養(yǎng)

在每升培養(yǎng)基中分別加入0.6 g復(fù)合維生素B（維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、泛酸、煙酸）、0.5%的草炭土、玉米秸稈、玉米芯及草炭加麥麩（3∶1）、玉米秸稈加麥麩（3∶1）、玉米芯加麥麩（3∶1）提取液，共7種外源營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

1.2.4 培養(yǎng)溫度

將液體菌種分別放入23℃、25℃、28℃搖床，轉(zhuǎn)速均為 150 r·min-1。

1.3 液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳搖瓶培養(yǎng)條件的碳源、氮源和外源營(yíng)養(yǎng)，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)[7]，通過(guò)測(cè)定菌絲生物量確定最佳煙色離褶傘液體菌種最佳培養(yǎng)配方。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平Tab.1Factors and levels of L9（33）orthogonal test

1.4 工廠化栽培研究選擇

1.4.1 各條件選擇

1） 培養(yǎng)基配方

菌絲培養(yǎng)期間溫度為25℃，黑暗培養(yǎng)；出菇階段溫度為16℃～18℃，濕度90%～97%。設(shè)置3個(gè)工廠化栽培培養(yǎng)基配方，分別為：配方1（草炭78%、麥麩20%、石膏1%和石灰1%）；配方2（草炭28%、玉米芯25%、玉米秸稈25%、麥麩20%、石膏1%和石灰1%）；配方3（菌糠40%、秸稈38%、麥麩20%、石膏1%和石灰1%）。采用850 mL聚丙烯瓶，覆土栽培，每個(gè)配方生產(chǎn)100瓶。

2）人工栽培容器選擇

選用500 mL罐頭瓶（培養(yǎng)基裝1/2、裝滿瓶）、850 mL細(xì)口聚丙烯瓶、30 cm×30 cm×15 cm聚丙烯盆、耐高溫廣口丙烯組培瓶2組（高14.0 cm，口徑11.4 cm，底面直徑 10.0 cm；高 8.5 cm，口徑 9.5 cm，底面直徑8.3 cm）進(jìn)行覆土栽培（草炭土厚度0.5 cm）。

3） 覆土與未覆土

采用細(xì)口聚丙烯瓶栽，搔菌后進(jìn)行覆土與未覆土2種處理方式，草炭土覆土厚度為0.5 cm。

1.4.2 檢測(cè)數(shù)據(jù)

觀察各菌株子實(shí)體的形態(tài)特征，不同栽培條件重復(fù)隨機(jī)選取10個(gè)子實(shí)體，測(cè)量菌蓋直徑、菌蓋厚度及菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑，取其平均值。用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。生物學(xué)效率（BE，%）的計(jì)算公式為：

BE=Ffw/Sdw×100%

式中：Ffw表示子實(shí)體鮮重（g）；Sdw表示培養(yǎng)料干重 （g）。

1.4.3 人工栽培和野生煙色離褶傘營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

委托中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)生態(tài)所農(nóng)產(chǎn)品安全與環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)中心檢測(cè)其干品18種氨基酸、粗多糖、蛋白質(zhì)等含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體菌種單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況的影響見(jiàn)表2。

表2 不同碳源液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況Tab.2 Effects of different carbon source on mycelial growth

由表2可知，綜合比較，2%麥芽糖菌球密度最大，菌絲生物量最重，菌球直徑相對(duì)較小、整齊，因此煙色離褶傘液體培養(yǎng)的最適碳源為麥芽糖。

2.1.2 氮源對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況的影響見(jiàn)表3。

表3 不同氮源液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況Tab.3 Effects of different nitrogen source on mycelial growth

由表3可知，尿素抑制菌球生長(zhǎng)。綜合比較，0.2%黃豆粉菌球密度最大，菌球直徑最小、整齊，菌絲生物量相對(duì)較重，因此煙色離褶傘液體培養(yǎng)的最適氮源為黃豆粉。

2.1.3 外源營(yíng)養(yǎng)物對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

不同外源營(yíng)養(yǎng)物對(duì)煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況的影響見(jiàn)表4。由表4可知，綜合比較，0.6 g·L-1復(fù)合維生素B菌球密度最大，菌球直徑最小、整齊，菌絲生物量相對(duì)較重，因此煙色離褶傘液體培養(yǎng)的最適外源營(yíng)養(yǎng)物為復(fù)合維生素B。

2.1.4 溫度對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

不同溫度對(duì)煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況的影響見(jiàn)表5。由表5可知，綜合比較，23℃菌球密度最大，菌球直徑最小、整齊，菌絲生物量相對(duì)較重，因此煙色離褶傘液體培養(yǎng)的最適溫度為23℃。

2.2 液體菌種正交試驗(yàn)結(jié)果

最佳培養(yǎng)條件液體菌種正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，液體菌種生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。由表6、圖1可知，正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證確定煙色離褶傘菌種培養(yǎng)最佳組合為A3B2C2，即碳源麥芽糖2.5%，氮源黃豆粉0.2%，外源營(yíng)養(yǎng)復(fù)合維生素B 0.6 g·L-1，而且液體菌種菌球顆粒小、密度大。

表4 不同外源營(yíng)養(yǎng)物對(duì)液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況Tab.4 Effects of different exogenous compound on mycelial growth

表5 不同溫度液體菌種菌絲生長(zhǎng)情況Tab.5 Effects of different temperature on mycelial growth

2.3 工廠化栽培研究結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)基配方試驗(yàn)結(jié)果

工廠化栽培不同配方對(duì)煙色離褶傘農(nóng)藝性狀的影響見(jiàn)表7。由表7可知，煙色離褶傘菌絲在3種培養(yǎng)料中均可生長(zhǎng)和出菇。配方3從接種到出菇所用時(shí)間最短，為68 d～72 d，配方2最慢，但配方2的生物學(xué)效率明顯高于配方1和配方3，達(dá)68%；子實(shí)體顏色均為灰色，3個(gè)配方菌蓋大小及厚度差異不明顯，配方1菌柄明顯短于其他2個(gè)配方。

2.3.2 不同栽培方式試驗(yàn)結(jié)果

不同栽培方式對(duì)煙色離褶傘農(nóng)藝性狀的影響見(jiàn)表8。由表8可知，6種栽培方式均能出菇，菌齡與培養(yǎng)料多少有關(guān)，采用耐高溫聚丙烯組培瓶栽培（?。訉?shí)體菌蓋明顯小于其他5種栽培方式，菌柄長(zhǎng)于其他3種栽培方式。生物學(xué)效率差異明顯，生物學(xué)效率大小依次為細(xì)口聚丙烯瓶栽＞盆栽＞耐高溫廣口聚丙烯組培瓶（大） ＞罐頭瓶（滿） ＞聚丙烯廣口組培瓶（?。竟揞^瓶（1/2）。細(xì)口聚丙烯瓶由于瓶口小，養(yǎng)分供應(yīng)比較集中，氧氣含量較低，保濕性好，菇蕾發(fā)生整齊，菇柄長(zhǎng)，子實(shí)體生長(zhǎng)整齊，產(chǎn)量明顯高于其他幾種出菇方式。

2.3.3 覆土試驗(yàn)結(jié)果

覆土栽培與未覆土栽培對(duì)煙色離褶傘農(nóng)藝性狀的影響見(jiàn)表9。由表9可知，未覆土煙色離褶傘菌株比覆土栽培生育期短約5 d，子實(shí)體農(nóng)藝性狀指標(biāo)小于覆土栽培，栽培生物學(xué)效率為66%，覆土后生物學(xué)效率達(dá)68%，生物學(xué)效率差異不明顯，從節(jié)約成本角度考慮工廠化栽培可以不覆土處理。

2.3.4 人工栽培和野生煙色離褶傘營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)

煙色離褶傘營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果見(jiàn)表10。由表10可知，野生煙色離褶傘子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量為32.200 0%，粗多糖含量為6.450 0%，18種氨基酸總量為20.270 7 g·100-1g-1；栽培煙色離褶傘蛋白質(zhì)含量為32.000 0%，粗多糖含量為3.020 0%，18種氨基酸含量19.393 0 g·100-1g-1。人體必需氨基酸含量中，人工栽培的煙色離褶傘含量為8.014 6 g·100-1g-1，比野生含量（6.530 8 g·100-1g-1）高1.483 8 g·100-1g-1。

3 結(jié)論

煙色離褶傘菌種最佳營(yíng)養(yǎng)條件為碳源麥芽糖2.5%，氮源黃豆粉0.2%，外源營(yíng)養(yǎng)復(fù)合維生素B 0.6 g·L-1。采用此配方，搖床培養(yǎng)溫度為23℃的條件下菌球顆粒小、密度大，菌絲生物量最高；工廠化栽培培養(yǎng)基配方草炭28%、玉米芯25%、玉米秸稈25%、麥麩20%、石膏1%、石灰1%，子實(shí)體產(chǎn)量最高為68%；煙色離褶傘工廠化栽培宜選用聚丙烯瓶；試驗(yàn)菌株采用覆土方式生物學(xué)效率略高于未覆土，但將增加人工成本，因此可不進(jìn)行覆土處理；野生煙色離褶傘和人工栽培的干品子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量近似，野生煙色離褶傘中氨基酸總量和粗多糖總含量均高于人工栽培的煙色離褶傘，但在人體必需氨基酸含量中，人工栽培比野生的煙色離褶傘高1.483 8 g·100-1g-1。

表7 不同配方對(duì)煙色離褶傘農(nóng)藝性狀的影響Tab.7 Effects of different formulas on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表8 不同栽培方式煙色離褶傘農(nóng)藝性狀的影響Tab.8 Effects of different cultivation method on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表9 覆土與未覆土對(duì)煙色離褶傘農(nóng)藝性狀的影響Tab.9 Effect of covering soil on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表10 煙色離褶傘營(yíng)養(yǎng)成分分析Tab.10 Nutritional components analysis of cultivated and wild Lyophyllum fumosum

煙色離褶傘氨基酸總量明顯高于金針菇13.686 g·100-1g-1～16.096 g·100-1g-1[8]，蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于白玉菇 17.56 g·100-1g-1[9]、真姬菇 22.30 g·100-1g-1[10]、杏鮑菇20.00 g·100-1g-1[11]。煙色離褶傘是一種高蛋白、低脂肪營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的食用菌新品種，但對(duì)其成分分析卻較少，許多潛在價(jià)值尚未得到開(kāi)發(fā)利用[12]。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)煙色離褶傘子實(shí)體深加工及產(chǎn)物成分和主要功能的研究，為煙色離褶傘市場(chǎng)開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。