權(quán)新華，武 鑫，溫 蝶，溫志強(qiáng)**

（1.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002；2.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016）

灰樹花（Grifola frondosa）又名貝葉多孔菌、栗子蘑、云蕈、蓮花菇、舞茸等，隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱（Hymenomycetes） 非褶菌目（Aphyllophorales） 多孔菌科（Polyporaceae） 樹花菌屬（Grigola），是一種中溫型、好氧、喜光的木質(zhì)腐生菌，在夏、秋季節(jié)常生于櫟樹、板栗樹或其他闊葉樹的樹樁周圍，是一種重要的食藥兼用蕈菌[1]，具有巨大的潛在開發(fā)利用價值。

我國灰樹花育種研究較晚，很多菌種都存在適應(yīng)能力差、易染雜菌、生物轉(zhuǎn)化率偏低等問題[2]，需要及時育種并篩選出優(yōu)良菌株[3]。雜交是獲得優(yōu)良性狀菌種的一種方法，能使遺傳物質(zhì)在細(xì)胞水平重組，從而將不同類型菌株的優(yōu)良性狀結(jié)合，并可通過菌絲體的無性繁殖穩(wěn)固這種優(yōu)良性狀。

RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食用菌的親緣關(guān)系鑒定[4-7]。鑒此，通過這2種分子標(biāo)記技術(shù)，以白色菌株Gr0001+3為雜交核心親本，對與其他5株能正常開片朵型較好的菌株雜交后獲得的13株雜交子進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步驗證雜交子分類地位。同時探索適宜雜交子生長的溫度、pH等條件，為雜交子的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

灰樹花（Grifola frondosa） 栽培菌株Gr0001+3與栽培菌株Gr0005、Gr0008、Gr0013、Gr0024、Gr0026單單雜交，觀察篩選出具索狀聯(lián)合性狀的13株雜交子，保藏于福建省食用菌種質(zhì)資源保藏管理中心，菌株編號見表1。

表1 雜交子菌株編號Tab.1 Hybrid strains in the exprement

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1，pH 自然。

1.2 雜交子理化性質(zhì)測定

1.2.1 溫度試驗

制作90 mm的PDA平板培養(yǎng)基，每平板培養(yǎng)基定量20 mL。用6 mm打孔器在各雜交母種菌絲相同菌齡位置打孔，菌塊接種于平板中央。接種完成后的平板分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個菌株在不同溫度試驗下設(shè)置3個重復(fù)。用十字交叉畫線法測定菌絲的生長速度。

1.2.2 pH 試驗

用 1 mol·L-1NaOH 和 1 mol·L-1HCl制成不同pH 的 PDA 培養(yǎng)基，pH 分別調(diào)為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，每個90 mm平板定量20 mL培養(yǎng)基。用6 mm的打孔器在各雜交母種菌絲相同菌齡位置打孔，菌塊接種于平板中央。每個菌種不同pH做3個重復(fù)。用十字交叉畫線法測定菌絲的生長速度。

1.3 灰樹花雜交子分子標(biāo)記鑒定

1.3.1 菌絲培養(yǎng)及DNA提取

將雜交菌種接種于鋪有玻璃紙的PDA平板上，25℃靜置培養(yǎng)15 d后收集菌絲，采用CTAB法[8]提取全基因組DNA，置于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物與 PCR 擴(kuò)增

選取經(jīng)過多次檢驗且具有多拷貝的6條ISSR引物和RAPD引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表2。RAPD-PCR和ISSR-PCR擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓110 V，電流50 mA，電泳50 min。后于紫外凝膠成像儀拍照。

表2 RAPD和ISSR引物序列Tab.2 The primer sequence about RAPD and ISSR

1.3.3 數(shù)據(jù)分析與圖表繪制

使用Excel統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，取3組重復(fù)數(shù)據(jù)平均值繪制條形統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對灰樹花雜交子菌絲生長的影響

不同溫度下雜交子菌絲生長情況見圖1。

由圖1所示，在PDA平板上，雜交子菌絲在15℃～30℃均可生長，生長速度呈先升后降的趨勢，當(dāng)溫度升高到35℃時菌絲不再生長。雜交子最適生長溫度25℃，同一對親本雜交產(chǎn)生的雜交子在不同溫度下生長速度也不同。25℃條件下，Z5-1、Z8-1、Z8-2菌絲生長速度最快。

2.2 pH對灰樹花雜交子菌絲生長的影響

不同pH下雜交子菌絲生長情況見圖2。

由圖2可知，不同pH條件下雜交子菌絲生長速度不同，菌絲在pH 4～pH 8均可生長，生長速度呈先快后慢的趨勢，其中最適生長pH為5，說明灰樹花菌絲喜弱酸性，當(dāng)pH為5時，雜交子Z5-1、Z5-3、Z8-1、Z8-2、Z26-2菌絲生長優(yōu)于其他雜交子。

2.3 灰樹花雜交子分子標(biāo)記鑒定

RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記擴(kuò)增雜交子與親本條帶電泳圖見圖3。

由圖3所示，RAPD分子標(biāo)記驗證中使用S1518對Gr0001+3與Gr0005雜交產(chǎn)生的雜交子Z5-1擴(kuò)增效果較好，親本菌株與優(yōu)勢雜交子間的特異性條帶較明顯，從圖中可以看出雜交子Z5-1的條帶中同時包含了Gr0001+3和Gr0005的特異性條帶，從而在DNA分子水平上證明了Z5-1是Gr0001+3和Gr0005真正的雜交子。

同理ISSR分子標(biāo)記驗證中，ISSR2、ISSR4、ISSR12、ISSR13、ISSR816也對多個雜交子及親本擴(kuò)增良好，親本菌株與優(yōu)勢雜交子間的特異性條帶較明顯，從圖3中可以看出雜交子同時含有兩親本特異性條帶，證明了雜交子的真實性，也驗證了這幾個ISSR引物鑒定灰樹花雜交子的可行性。

現(xiàn)有的6個引物并不能鑒定所有的雜交子菌株，其余雜交子菌株P(guān)CR電泳圖只含有一個親本菌株的條帶，如雜交子Z13-1。當(dāng)以ISSR4為引物進(jìn)行擴(kuò)增，Z13-1雜交子的電泳條帶與Gr0013親本的相似，不含有Gr0001+3的特異性條帶，無法證明Z13-1是雜交子菌株。

3 討論

雜交可以使親本的基因重新組合，獲得不同類型的雜交子，為選擇提供豐富的材料。雜交子篩選是從大量雜交子中選出獲得優(yōu)良性狀的雜交子菌株，雜交子在菌絲生長速度、菌絲耐受性等多方面存在一定差異。本研究將雜交獲得的13個雜交子菌株放置于不同溫度、不同pH條件下培養(yǎng)，并測定菌絲生長速度，結(jié)果表明13個灰樹花雜交子的菌絲最適生長溫度均為25℃，菌絲最適生長pH為5，不同灰樹花雜交子菌株菌絲生長速度不同，其中Z5-1、Z5-3、Z8-1、Z8-2、Z26-2等菌株生長速度比其他菌株快。

雜交子代的鑒定和篩選是雜交育種中的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可以通過觀察鎖狀聯(lián)合、拮抗試驗、同工酶分析、分子標(biāo)記、菌絲長速、出菇試驗等方法進(jìn)行鑒定和篩選[10]。分子標(biāo)記分析待鑒定雜交子與雙親間的DNA特異性條帶，若其同時具有雙親獨(dú)有的條帶，則可以斷定其為雜交子，若其與任一親本的條帶完全一致，則不能確定其為雜交子[11-12]。DNA分子標(biāo)記技術(shù)是基于基因水平上的分子鑒定，其具有不受環(huán)境影響且精確度高等優(yōu)點(diǎn)，使鑒定結(jié)果更為可信。試驗中選用RAPD和ISSR分子標(biāo)記，對通過觀察具有索狀聯(lián)合篩選得到的雜交子進(jìn)行驗證，用6個引物對13株灰樹花菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中7株灰樹花雜交子菌株均包含各自雙親的特異性條帶，因此，在DNA分子水平上證明這7株菌株是真正的雜交子，證明了RAPD分子標(biāo)記和ISSR分子標(biāo)記在驗證灰樹花雜交子方面的可行性。由于篩選的引物數(shù)量較少，僅有6個引物能鑒定出雜交子，而且還有6株雜交菌株并未鑒定出，其也有可能是真正的雜交子，需要篩選更多引物進(jìn)一步驗證。