方潔鈺，張復(fù)茂，趙 寬

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013）

粉末牛肝菌屬（Pulveroboletus Murrill）在分類上隸屬于牛肝菌目 （Boletale） 牛肝菌科 （Boletaceae），是Murrill于1909年基于黃粉末牛肝菌（P.ravenelii）菌蓋有粉末這一特征，并以P.ravenelii為模式種建立的[1]。該屬主要鑒別特征為子實(shí)體較小，菌蓋扁平，表面有一層粉末，易脫落，濕潤時稍粘，蓋緣一般稍內(nèi)卷；菌肉為白色；菌柄近圓柱形，實(shí)心，菌環(huán)生柄上部，網(wǎng)狀，受傷后緩慢變成藍(lán)色；孢子呈淺黃褐色，牛肝菌型；擔(dān)子呈棒狀；側(cè)生囊狀體較長，上部短尖，中部凸出。該屬真菌具有重要的食（藥）用價值，如黃粉末牛肝菌有治療腰腿疼痛之功效[2-3]，網(wǎng)柄粉末牛肝菌（P.retipes）含有7種人體必需氨基酸[2]。而該屬中紅管粉末牛肝菌（P.amarellus）、褐點(diǎn)粉末牛肝菌（P.brunneopunctatus）等則被列入毒菇名錄，成為牛肝菌研究中的“明星類群”[2-4]。

通過形態(tài)解剖學(xué)與分子系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的研究，發(fā)現(xiàn)江西省粉末牛肝菌屬1個新記錄種——紅鱗粉末牛肝菌（Pulveroboletus rubroscabrosus），并對其進(jìn)行描述和報道，為該屬真菌的物種多樣性研究提供參考。

1 研究材料與方法

1.1 供試標(biāo)本

2份標(biāo)本分別于2017年、2018年采集于中國科學(xué)院廬山植物園，經(jīng)干燥處理后，保存于中國科學(xué)院昆明植物研究所隱花植物標(biāo)本館（HKAS 105244；HKAS 105245），同時保存與之配套的硅膠干燥材料用于分子實(shí)驗。

1.2 形態(tài)學(xué)研究

1.2.1 宏觀特征觀察

野外采集子實(shí)體并拍照，記錄采集地點(diǎn)、采集日期、采集人員以及子實(shí)體各部位結(jié)構(gòu)等特征。特征主要包括菌蓋大小、形狀和顏色，光滑或粘；菌肉的厚度、顏色；菌褶的厚度、顏色；菌柄的顏色、形狀、尺寸和著生方式；受傷后是否變色、變色的深淺程度和快慢等。

1.2.2 內(nèi)部顯微觀察

使用5%的氫氧化鉀溶液對標(biāo)本組織進(jìn)行顯微制片后，觀察、記錄擔(dān)孢子、擔(dān)子和囊狀體的形態(tài)、大小等數(shù)據(jù)，并與模式標(biāo)本（紅鱗粉末牛肝菌，HKAS 75537）的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。顯微特征均在顯微鏡下放大100倍（油鏡）觀察得到。統(tǒng)計數(shù)據(jù)中n/m/p表示測量p份標(biāo)本的m個子實(shí)體上的n個擔(dān)孢子，Q值表示擔(dān)孢子的長寬比，Qm則表示擔(dān)孢子長寬比 （±s）。

1.3 分子系統(tǒng)學(xué)研究

1.3.1 DNA 提取

采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，對硅膠干燥的分子材料進(jìn)行總DNA提取。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增與系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)所查閱的文獻(xiàn)資料和預(yù)試驗，最終選取的基因片段共5個，分別為核糖體大亞基編碼基因（nrLSU）[5]、翻譯延長因子編碼基因 （tef1-α）[6]、RNA聚合酶II第一大亞基編碼基因（rpb1）[7]、RNA聚合酶II第二大亞基編碼基因（rpb2）[8]以及核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）[9]，并使用NCBI數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)較為豐富的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

擴(kuò)增體系總體積為25 μL，包括 10×Buffer 2.5 μl，正反向引物各 0.5 μL，模板 DNA 1.0 μL，Taq酶 0.5 μL，ddH2O 20.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序的熱循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入連續(xù)35個循環(huán)，94℃變性40 s，退火 40 s（退火溫度：ITS 50℃、nrLSU 52℃、tef1-α、rpb1和 rpb2為 56℃），72℃延伸50 s，循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸8 min，終止溫度為10℃。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測條帶后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。所得序列采用BioEdit v7.0.9[10]打開，檢查序列峰形圖并仔細(xì)核對堿基讀取是否正確。同時，所得序列采用NCBI在線軟件blast與GenBank[11]數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，以確保所得序列與研究對象相對應(yīng)，避免污染。對序列進(jìn)行整理后利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定物種的系統(tǒng)發(fā)育位置及其與屬內(nèi)其他物種的親緣關(guān)系[12]。

2 研究結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

紅鱗粉末牛肝菌子實(shí)體生境照片見圖1。

由圖1所示，紅鱗粉末牛肝菌菌蓋凸鏡形，成熟后逐漸平展，直徑2 cm～3 cm，濕潤時稍粘，表面有一層橘紅色、平伏的絮狀鱗片，蓋緣稍內(nèi)卷；菌肉厚3 mm～4 mm，淺黃、略帶粉色，傷后變?yōu)闇\藍(lán)色。子實(shí)體表面淡黃色至暗黃色，受傷后迅速變?yōu)樗{(lán)黑色，幼時被檸檬黃色菌幕包裹；管口近圓形，直徑約2 mm；菌管淺檸檬黃色，高4 mm～5 mm，傷后緩慢變淺藍(lán)色。菌柄檸檬黃色，近圓柱形，（30～50）mm ×（4～6）mm，菌環(huán)生于菌柄中上部，菌環(huán)以下部位有與菌蓋上相同的鱗片；菌柄菌肉淺黃，基部金黃，菌絲近白色，受傷后局部緩慢變淺藍(lán)。其與模式標(biāo)本紅鱗粉末牛肝菌顯微特征比較見表1。

由表1所示，所研究標(biāo)本擔(dān)孢子為100/2/2，大小為 （7.5） 8 μm ～ 10 （11） μm × 4.5 μm ～ 5 （6）μm，Q ＝ （1.50） 1.70 ～ 2.20 （2.75），Qm ＝ 1.91 ±0.23，呈黃褐色，表面光滑無紋飾，牛肝菌形；擔(dān)子 （15～30） μm × （6～10） μm，在氫氧化鉀中近無色，短棒狀，內(nèi)部具油狀圓形小顆粒，整體呈柵欄狀排列，成熟擔(dān)子頂端多具4個小梗；褶緣囊狀體（40～75） μm× （7～13） μm，散生，無色，近紡錘狀或長披針形，頂端短尖，中部凸出。

表1 所研究標(biāo)本與模式標(biāo)本顯微特征比較Tab.1 Microscopic characteristics comparison between studied specimens and type specimen of P.rubroscabrosus

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果

通過對研究標(biāo)本ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增與測序，將所得結(jié)果與GenBank和UNITE等數(shù)據(jù)庫中可靠的序列進(jìn)行匹配和對比，結(jié)合GenBank中的其他序列資料，選擇雙色薄瓤牛肝菌（B.bicolor） 和紅孔牛肝菌（R.sinicus）作為外類群，采用褐糙粉末牛肝菌（P.brunneoscabrosus）、中華粉末牛肝菌（P.sinensis）、雷德粉末牛肝菌（P.ridleyi）、淡紅粉末牛肝菌（P.subrufus）、褐點(diǎn)粉末牛肝菌 （P.brunneopunctatus）、大孢粉末牛肝菌（P.macrosporus）、黃鱗粉末牛肝菌（P.flaviscabrosus）、紅鱗粉末牛肝菌（P.rubroscabrosus）、網(wǎng)蓋粉末牛肝菌 （P.reticulopileus）、東方蘭茂牛肝菌（L.asiatica） 共10種牛肝菌序列組建基因矩陣后用RAxML軟件（最大似然法）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

由圖2可知，所用的2條序列（加粗顯示） 與紅鱗粉末牛肝菌P.rubroscabrosus（HKAS 75537） 聚為一支。后續(xù)試驗所得的nrLSU、tef1-α、rpb1、rpb2序列，與GenBank中可靠的序列進(jìn)行匹配和對比，與紅鱗粉末牛肝菌序列同源性均達(dá)98%以上。

3 結(jié)論

綜合形態(tài)特征分析和分子系統(tǒng)學(xué)研究，鑒定出采集自江西省的2份標(biāo)本均為粉末牛肝菌屬中的紅鱗粉末牛肝菌。與產(chǎn)自湖北神農(nóng)架的該物種的模式標(biāo)本（HKAS 75537） 相比[13]，形態(tài)上略存在差異，如受傷后的變色情況、孢子和擔(dān)子大小等，從而豐富了對于該物種的認(rèn)識，為物種精準(zhǔn)鑒定提供了更全面的信息。

目前，針對江西省牛肝菌資源開展的研究還相對較少[14-16]。本次新記錄種的發(fā)現(xiàn)，為認(rèn)識江西省大型真菌資源多樣性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。牛肝菌科真菌多為外生菌根菌，包含食（藥）用菌和毒菌，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值，在資源開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域逐漸引起重視[17-18]。粉末牛肝菌屬的部分物種能祛風(fēng)散熱、活絡(luò)筋骨，具有重要的藥用價值[2，17]；同時，該屬的毒菌被誤食可引起胃腸不適或致幻[13]。因此，紅鱗粉末牛肝菌在江西省的首次報道，對于充分認(rèn)識該區(qū)食（藥）用真菌資源、預(yù)防毒菌中毒也有重要意義。