李招兵，馬小峰，江振濤，黃云輝

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 心內(nèi)科， 湖南 衡陽 421001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是一種以血管內(nèi)皮功能障礙、血管炎性反應(yīng)以及脂質(zhì)、膽固醇和鈣在血管壁內(nèi)膜的積聚為特征的大中型肌動脈疾病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用[1]。姜黃素(curcumin)是一種從姜黃中分離出來的疏水性多酚，對心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用[2]。但其水溶性差，生物利用度較低。相比之下，其衍生物煙酸姜黃素酯(nicotinate-curcumin，NC)具有更好的水溶性和溶液穩(wěn)定性，能調(diào)節(jié)載脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠的脂質(zhì)代謝，并能抑制泡沫細(xì)胞形成[3-4]，然而其確切機(jī)制仍然不清楚。

磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activate protein kinase，AMPK)是一種參與維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的激酶，廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[5]。如AMPK能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB的激活，并能減少TNF-α的分泌，減輕ApoE缺陷小鼠動脈損傷而減輕動脈粥樣硬化[6-7]。盡管NC已被證明具有抗感染特性，但其對心血管疾病的作用尚不完全明確。本研究旨在探討NC對動脈粥樣硬化形成的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及試劑盒：煙酸姜黃素酯(南華大學(xué)藥物藥理研究所，純度﹥98%)；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(Sigma-Aldrich公司)；BCECF/AM熒光染料、LipofectamineTMRNAiMAX試劑(Invitrogen公司)；磷酸化AMPK(Thr172；1︰1 000)、抗-AMPK、抗-磷酸化NFκB p65和抗-NF-κB p65抗體(Cell Signaling Technology公司)；抗-ICAM-1、抗-VCAM-1、抗-E-選擇素、抗-磷-eIF2α、抗-eIF2α、抗-磷-IRE-1、抗-IRE-1、抗-CHOP和抗-β-actin抗體(Santa Cruz公司)；硝酸纖維素膜、化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham公司)； TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(R&D公司)；過氧化氫試劑盒(Abcam公司)。

1.1.2 細(xì)胞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC，ATCC公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：用含10%胎牛血清、鏈霉素(100 U/μL)和青霉素(100 U/μL)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2和95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs。約每2 d更換次培養(yǎng)基。傳代時(shí)用胰蛋白酶-EDTA(0.05 g/L胰蛋白酶，0.02 g/L EDTA)分離匯合細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至第3～7代后用于下一步研究。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達(dá)或磷酸化： 收集處理后細(xì)胞，用裂解緩沖液在4 ℃下裂解60 min以提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白質(zhì)樣品(35 μg)經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后，加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min。最后采用使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。

1.2.3 RNA干擾實(shí)驗(yàn)： 根據(jù)試劑盒的說明書，將AMPK siRNA或?qū)φ誷iRNA(20 nmol/L)轉(zhuǎn)染至HUVECs。簡言之，將1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后加入轉(zhuǎn)染混合物，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后換用新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4 細(xì)胞黏附的實(shí)驗(yàn)： 用LPS(200 ng/mL)和NC(20 μmol/L)處理HUVECs 24 h，然后與BCECF/AM熒光探針標(biāo)記的單核巨噬細(xì)胞THP-1共培養(yǎng)。1 h后，用磷酸緩沖鹽溶液PBS漂洗3次后，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α和IL-6的水平： 將接種于24孔板中的HUVECs細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，收集每孔培養(yǎng)基上清，根據(jù)試劑盒的說明，用人TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒測定上清液中TNF-α和IL-6的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 煙酸姜黃素酯經(jīng)AMPK途徑抑制LPS激活HUVECs中的NF-κB

20 μmol/L NC處理HUVECs 24 h后，磷酸化AMPK水平顯著增高(P<0.05)(圖1A)。相比之下，LPS處理后所致的NF-κB p65亞基磷酸化能被NC所抑制(圖1B)。而采用AMPK siRNA處理后，NC對p65磷酸化的抑制效應(yīng)明顯減弱。

2.2 煙酸姜黃素酯抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs黏附分子表達(dá)和單核細(xì)胞黏附

LPS處理前用20 μmol/L NC預(yù)處理細(xì)胞后，ICAM-1，VCAM-1和E選擇素表達(dá)明顯降低(圖2A)。此外， THP-1細(xì)胞與HUVECs的黏附作用也明顯減少(圖2B)。而預(yù)先采用AMPK siRNA沉默其表達(dá)后，NC的上述效應(yīng)有所減弱。

2.3 煙酸姜黃素酯下調(diào)LPS誘導(dǎo)HUVECs分泌促炎細(xì)胞因子

LPS處理HUVECs后，培養(yǎng)上清中TNF-α和MCP-1水平顯著增高，而經(jīng)NC預(yù)處理后，其含量明顯減少(P<0.05)。此外，采用siRNA沉默AMPK后，NC的抑制效應(yīng)有所降低(圖3)。

2.4 煙酸姜黃素酯經(jīng)AMPK減輕LPS誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

NC處理后可下調(diào)LPS所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子IRE-1、eIF2α和CHOP的表達(dá)水平。而干擾AMPK表達(dá)后，可明顯削弱煙NC對這些分子的抑制效應(yīng)(P<0.05)(圖4)。

3 討論

在動脈粥樣硬化過程中，促炎細(xì)胞因子和黏附分子誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附和滲透到內(nèi)皮是動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵[8]。先前的研究結(jié)果表明，NC防性給藥能抑制高脂喂養(yǎng)所致的ApoE-/-小鼠動脈硬化斑塊的形成，并能降低血清中TNF-α和IL-6的水平[9]。在本研究中，采用NC作用于人血管內(nèi)皮細(xì)胞后，對LPS誘導(dǎo)的TNF-α和MCP-1分泌明顯減少，而用siRNA沉默AMPK的表達(dá)后，則可明顯消除該效應(yīng)。表明NC有可能通過激活A(yù)MPK而發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)的作用。研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素處理能促進(jìn)AMPK的磷酸化[10]。NF-κB是炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中調(diào)控各種細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。此外，黏附分子如ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素的表達(dá)也受NF-κB的調(diào)節(jié)[11]。本研究也證實(shí)，NC處理后，LPS誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞中的NF-κB磷酸化明顯降低。與預(yù)期結(jié)果一致，LPS誘導(dǎo)單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及VCAM-1、ICAM-1和E-選擇素的表達(dá)也有所降低。該效應(yīng)均可被AMPK siRNA所逆轉(zhuǎn)。因此，以上結(jié)果表明NC延緩動脈粥樣硬化發(fā)生進(jìn)展可能得益于其對AMPK信號通路的激活。

A.effect of nicotinate-curcumin on AMPK phosphorylation; B.silence of AMPK abrogates nicotinate-curcumin inhibited p65 phosphorylation upon LPS stimulation; *P<0.05 compared with the indicated groups圖1 煙酸姜黃素酯對AMPK和NF-κB磷酸化的影響Fig 1 Nicotinate-curcumin affected phosphorylation of AMPK and

A.effect of nicotinate-curcumin on adhesion molecules expression upon LPS stimulation; *P<0.05 compared with the LPS groups；#P<0.05 compared with the NC+LPS groups； B.nicotinate-curcumin blocked the LPS-induced adhesion of THP-1 cells to HUVECs;*P<0.05 compared with the indicated groups圖2 煙酸姜黃素酯對LPS誘導(dǎo)的黏附相關(guān)分子表達(dá)及單核細(xì)胞黏附的影響Fig 2 Nicotinate-curcumin inhibited the expression of LPS-induced adhesion molecules and adhesion of

The inhibitory effec of nicotinate-curcumin on LPS-induced pro-inflammation TNF-α(A) and MCP-1 (B) secretion; *P<0.05 compared with the LPS groups; #P<0.05 compared with the NC+LPS groups圖3 煙酸姜黃素酯對LPS誘導(dǎo)HUVECs分泌促炎細(xì)胞因子的影響Fig 3 Nicotinate-curcumin ameliorated LPS-induced pro-inflammation cytokines secretion in

*P<0.05 compared with the LPS groups；#P<0.05，compared with the NC+LPS groups圖4 沉默AMPK對煙酸姜黃素酯減輕HUVECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志分子表達(dá)的影響Fig 4 Silence of AMPK on nicotinate-curcumin attenuated LPS-induced endoplasmic reticulum stress associated moleculars in

本研究證實(shí)了NC能減輕LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，具體表現(xiàn)為IRE-1、eIF2α和CHOP的表達(dá)水平降低;而干擾AMPK表達(dá)后，可明顯削弱NC對這些分子的抑制效應(yīng)，表明NC減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AMPK的活性有關(guān)。用β-氨基異丁酸(BAIBA)處理后，鏈脲佐菌素/高脂飲食誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠肝組織中eIF2α和JNK磷酸化降低，GRP78和ATF4表達(dá)減少，從而改善2型糖尿病小鼠的肝細(xì)胞凋亡和肝損傷[12]。然而，采用siRNA沉默AMPK后可消除這些作用。這些結(jié)果也輔助證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受AMPK途徑調(diào)控，NC誘導(dǎo)的AMPK活化可能以一種氧化應(yīng)激獨(dú)立的方式抑制ER應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和動脈粥樣硬化進(jìn)展。

總之，本研究證明NC通過AMPK依賴性信號傳導(dǎo)改善了LPS誘導(dǎo)的NF-κB磷酸化，消除了LPS誘導(dǎo)的黏附分子和內(nèi)皮中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。此外，NC通過激活A(yù)MPK抑制LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激，從而減輕動脈粥樣硬化進(jìn)展。提示,NC應(yīng)是一種治療動脈粥樣硬化的潛在藥物。在未來研究中，將采用ApoE或低密度脂蛋白受體缺陷型小鼠進(jìn)一步明確NC對動脈粥樣硬化病變的大小和斑塊穩(wěn)定性的影響，并用生物素結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確NC的特定受體來闡其激活A(yù)MPK機(jī)制。