陳日玲，鄭偉榮，譚 霖，劉東強(qiáng)，史 惠，陳啟康*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬順德婦女兒童醫(yī)院 兒科， 廣東 順德 528300； 2.泉州市第一醫(yī)院 兒科, 福建 泉州 362000；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒童醫(yī)學(xué)中心， 廣東 湛江 524023)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)是一種全能干細(xì)胞，具有被誘導(dǎo)分化為機(jī)體中的各種細(xì)胞類(lèi)型的潛能[1]。隨著干細(xì)胞研究的深入，建立了 “誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞”技術(shù)，使體細(xì)胞有望重新編程為類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的全能分化潛能細(xì)胞。對(duì)于胚胎干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(haematopoietic stem cell or haematopoietic progenitor cells，HSC/HPCs)相關(guān)機(jī)制的探索目前仍是一個(gè)研究熱點(diǎn)[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在胚胎干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞方面存在某種聯(lián)系[3]。

Jagged-1是Notch主要的配體之一, 可與鄰近細(xì)胞表面Notch的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合而觸發(fā) Notch 信號(hào)通路，通過(guò)HSE-1、DeiteX、Nur77、NF-κB和Numb等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而活化Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路。 DAPT為γ分泌酶抑制劑[4-5]，可抑制早老素(presenilin1，PS1)依賴(lài)的γ分泌酶活性，進(jìn)而抑制Notch受體的融蛋白性裂解即S3切割，阻斷Notch受體活化的中心環(huán)節(jié)，使Notch受體分子無(wú)法進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成有效的活性片段，最終抑制Notch信號(hào)通路的激活。

本研究旨在通過(guò)使用Jagged-1活化Notch信號(hào)通路及DAPT(γ-分泌酶抑制劑)抑制Notch信號(hào)通路，研究不同條件下該通路對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為造血干/祖細(xì)胞中的影響，探討Notch信號(hào)通路在小鼠胚胎干細(xì)胞分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞:清潔級(jí)8 ～10周昆明小鼠(19～22 g)(廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；細(xì)胞系：小鼠胚胎干細(xì)胞系C57[賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：Knockout DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸、谷氨酰胺、2-巰基乙醇、青霉素、鏈霉素0.25% Trypsin-0.02% EDTA(胰蛋白酶)(Gibco公司)；白血病抑制因子(Life Technology公司)；抗體Anti-Mouse Sca-1 FITC、抗體Rat IgG2a K Isotype Control FITC、抗體Anti-Mouse CD34 eFluor 660、抗體Rat IgG2a K Isotype Control eFluor 660、抗體Anti-Mouse CD117 PE、抗體Rat IgG2a K Isotype Control PE(Ebioscience公司)；Notch 1 抗體 (A-8)和CD34抗體(Santa Cruz公司)；Protein Jagged-1(小鼠):Fc(human)(rec.)(AdipoGe公司)；DAPT(Selleckchem公司)；DMSO(MP Biomedicals公司)；絲裂霉素C(上海新亞公司)；氯仿、異丙醇、Tris堿、硼酸(廣州化學(xué)制劑總廠(chǎng))；DEPC(Sigma-Aldrich公司)；瓊脂糖(Hydragene公司)；DNase Ⅰ(RNase-free)(TaKaRa公司)；Real-time PCR試劑盒(TOYOBO公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外培養(yǎng)原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)作為胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層：無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)取出孕12.5 d胚胎，將軀干組織剪碎，消化法獲得細(xì)胞懸液，鋪皿后體外培養(yǎng)，隔天換液，2～3 d消化法傳代培養(yǎng)。取第2～4代細(xì)胞經(jīng)10 μg/mL絲裂霉素C處理作為飼養(yǎng)層。

1.2.2 體外增殖小鼠胚胎干細(xì)胞： 復(fù)蘇小鼠胚胎干細(xì)胞在經(jīng)10 μg/mL絲裂霉素C處理好的飼養(yǎng)層上，加含1 000 U/mL白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的ESCs培養(yǎng)基，每天或隔天換液，3～4 d消化傳代培養(yǎng)。

1.2.3 體外誘導(dǎo)分化小鼠胚胎干細(xì)胞

1.2.3.1 擬胚體形成：將誘導(dǎo)生長(zhǎng)的擬胚體經(jīng)0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化后, 吹打制成單細(xì)胞懸液，差時(shí)貼壁法分離去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，在無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)LIF(1 000 U/mL)條件下培養(yǎng)4 d，可形成球形擬胚體。

1.2.3.2 細(xì)胞的分組及處理：按計(jì)劃分5組加藥處理培養(yǎng)10 d。

EB(擬胚體細(xì)胞，embryoid cell)組、對(duì)照組、Jagged-1組、DAPT組和Jagged-1-DAPT組。其中EB組即為擬胚體細(xì)胞凍存10 d后復(fù)蘇組；對(duì)照組為無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)LIF培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)擬胚體細(xì)胞，處于自然分化狀態(tài)；其余各組為加入活化劑或(和)抑制劑并在無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)1 000 U/mL LIF條件下培養(yǎng)的擬胚體細(xì)胞(Jagged-11 00 ng/mL, DAPT 10 nmol/mL)，加藥后培養(yǎng)10 d，屬于調(diào)控分化狀態(tài)。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)小鼠造血干/祖細(xì)胞：收集誘導(dǎo)分化培養(yǎng)10 d的細(xì)胞，流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)小鼠胚胎干細(xì)胞特異性表型CD31、SSEA1及造血干/祖細(xì)胞特異性表型CD117、 CD34、Sca1。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)：抽提上述誘導(dǎo)10 d各組細(xì)胞的總RNA, RT-qPCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路基因Notch1、Notch2、Notch4和Hes1；小鼠胚胎干細(xì)胞表型基因SSEA1、 Oct4；及造血干/祖細(xì)胞表型基因Sca1、H2k和c-kit。

表1 PCR引物序列和產(chǎn)物大小Table 1 Sequence of PCR primers and size of PCR products

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 擬胚體形成

ESCs體外增殖對(duì)飼養(yǎng)層條件要求較高，飼養(yǎng)層細(xì)胞(MEF)活性好,則ESCs增殖迅速，形成的鳥(niǎo)巢樣克隆數(shù)多，形態(tài)均一。而飼養(yǎng)層活性差時(shí),ESCs克隆數(shù)明顯減少，且大小不一；去除抑制分化的飼養(yǎng)層及LIF，懸浮培養(yǎng)2～3 d可形成球形擬胚體(embryoid body)，即EB組細(xì)胞(圖1): A: MEF原代體外培養(yǎng) 細(xì)胞展開(kāi)呈梭形，增殖狀態(tài)好，2～3 d匯合度90%或以上；B：飼養(yǎng)層制備,經(jīng)絲裂霉素C處理24 h后可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)呈明顯的纖維樣改變；C： ESCs體外增殖,ESCs培養(yǎng)3～4 d形成明顯的克隆，克隆數(shù)較少且克隆大小不等，形態(tài)基本規(guī)則；D：誘導(dǎo)EB形成,擴(kuò)增的ESCs克隆消化為單細(xì)胞，去除LIF及飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)，2～3 d后出現(xiàn)球形擬胚體。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察ESCs分化的細(xì)胞

將擬胚體消化成單細(xì)胞后接種在明膠預(yù)處理的6孔板中，細(xì)胞貼壁后加藥，觀察各組分化情況(圖2)。A: 擬胚體細(xì)胞鏡下形態(tài)，細(xì)胞呈克隆樣，克隆表面光滑，邊緣清晰，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間黏附性強(qiáng)，透光度較高，顏色較均勻；B: 為自然分化干細(xì)胞鏡下形態(tài)，細(xì)胞呈克隆樣，克隆體積變大，邊緣較清晰，但細(xì)胞間黏附性較差，結(jié)構(gòu)松散，透光度較差，內(nèi)可見(jiàn)較多棕色團(tuán)塊；C:為加入Jagged-1后干細(xì)胞鏡下形態(tài)，細(xì)胞雖呈克隆，體積增大，但細(xì)胞排列較緊密，邊緣清晰，透光度降低，克隆內(nèi)見(jiàn)小部分深色團(tuán)塊；D：為加入DAPT后干細(xì)胞鏡下形態(tài)，細(xì)胞呈克隆樣，克隆體積明顯增大，形狀不規(guī)則，邊緣模糊，克隆間相互聯(lián)系，結(jié)構(gòu)松散，克隆內(nèi)呈淡黃, 透光度差。E: 為加入Jagged-1及DAPT后干細(xì)胞鏡下形態(tài)，細(xì)胞呈克隆樣，與D組情況類(lèi)似，可見(jiàn)克隆體積增大，形狀不規(guī)則，邊緣模糊，克隆內(nèi)可見(jiàn)呈黃色或深棕色團(tuán)塊。

2.3 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)鑒定細(xì)胞分化結(jié)果

流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)10 d各組細(xì)胞的分化效果(表 2)。EB形成時(shí)已有少量ESCs分化為CD117+CD34+Sca1+造血干/祖細(xì)胞；Jagged-1組細(xì)胞胚胎干細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組和 Jagged-1-DAPT組明顯增多(P<0.05)(圖3，5)。Jagged-1-DAPT組分化的HSC/HPC數(shù)較control組及Jagged-1組明顯增多(P<0.05)(圖4，6)。

A.microscopic morphology of MEF primary culture in vitro; B.microscopic morphology of feeding layer preparation; C.microscopic morphology of ESCs in vitro proliferation; D.microscopic morphology of induced EBs formation圖1 不同時(shí)期擬胚體的形態(tài)特點(diǎn)Fig 1 Formation of embryoid bodies at different times

A.microscopic morphology of embryoid cells(EBs)； B.microscopic morphology of naturally differentiated stem cells(control)； C.microscopic morphology of stem cells after Jagged-1 was added(Jagged-1)； D.microscopic morphology of stem cells after DAPT was added(DAPT); E.microscopic morphology of stem cells after DAPT and Jagged-1 was added(Jagged-1-DAPT)圖2 誘導(dǎo)10 d后各組的擬胚體的形態(tài)特點(diǎn)Fig 2 Formation of embryoid bodies for 10 days in each group

表2 CD31+SSEA1+細(xì)胞及CD117+CD34+Sca1+細(xì)胞在各組中所占百分比Table 2 Percentage of CD31+SSEA1+ cell and CD117+ CD34+Sca1+ cells in each

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

2.4.1 檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)表型基因SSEA1、Oct4、c-Kit、H-2k和Sca1表達(dá)量變化如下：與ESCs組相比，除Jagged-1組SSEA1及Oct4 mRNA表達(dá)量外無(wú)明顯降低，其余各實(shí)驗(yàn)組的SSEA1(P<0.01)及Oct4(P<0.05)mRNA表達(dá)量明顯降低，提示存在ESCs分化，而Jagged-1組蛋白通過(guò)激活Notch通路抑制ESCs的分化；檢測(cè)造血干/祖細(xì)胞基因特異性基因c-Kit、H-2k，各實(shí)驗(yàn)組均可測(cè)出。DAPT組及Jagged-1-DAPT組表達(dá)量較其余各組明顯增多(P<0.05)。

2.4.2 Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch1、Notch 2、Notch 4表達(dá)量變化： 與ESCs組細(xì)胞相比，Jagged-1-DAPT組、DAPT組及對(duì)照組的Notch1,2,4的mRNA的表達(dá)量均有降低，考慮為胚胎干細(xì)胞分化后Notch1,2,4基因可能受到抑制；DAPT組及Jagged-1-DAPT組之Notch1、Notch4表達(dá)量較對(duì)照組降低(P<0.05)(表3)。

圖3 胚胎干細(xì)胞分化流式圖Fig 3 Flow chart of the embryonic stem cells

圖4 造血干細(xì)胞分化流式圖Fig 4 Flow chart of the haematopoietic stem cells

#P<0.05 compared with EB group;▲P<0.05 compared with concrol group; *P<0.05 compared with Jagged-1 group圖5 CD31+SSEA+胚胎干細(xì)胞百分比Fig 5 Percentage of CD31+SSEA+ in each groups

3 討論

胚胎干細(xì)胞具有多種分化潛能，可定向誘導(dǎo)分化成特異性細(xì)胞。如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等。其中造血干細(xì)胞移植可用于治療造血及免疫系統(tǒng)功能障礙性疾病[6-7],如何誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞高效分化為造血干細(xì)胞仍是目前研究的熱點(diǎn)。

#P<0.05 compared with EB group;▲P<0.05 compared with concrol group; *P<0.05 compared with Jagged-1 group圖6 CD117+CD34+Sca-1+造血干/祖細(xì)胞百分比Fig 6 Percentage of CD117+CD34+Sca-1+ in each

在造血干細(xì)胞中可以檢測(cè)到Notch受體與配體的表達(dá)[8-9]，現(xiàn)在已經(jīng)確定胚胎干細(xì)胞在胚胎期間形成, 這個(gè)過(guò)程完全依賴(lài)于Notch信號(hào)的傳導(dǎo)。研究表明，幾個(gè)Notch功能突變體包括Notch1、RBPj、Mindbomb和Jagged-1丟失后可影響胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育[10]。

本實(shí)驗(yàn)研究觀察到各組加藥誘導(dǎo)分化階段細(xì)胞與EB組細(xì)胞比較示，對(duì)照組中自然分化下細(xì)胞呈集落樣，集落內(nèi)可見(jiàn)少許形態(tài)不一致細(xì)胞，提示自然環(huán)境下胚胎干細(xì)胞已存在分化；DAPT-Jagged-1組及DAPT組已形成較大的集落， 與對(duì)照組及Jagged-1組比較有明顯的差異，形態(tài)學(xué)上提示胚胎干細(xì)胞已分化的可能性極大， 而從形態(tài)學(xué)推斷Jagged-1能激活Notch通路抑制了胚胎干細(xì)胞分化，DAPT阻斷Notch通路能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化。

表3 各組細(xì)胞各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 3 mRNA expression of related genes in each group n=9)

Notch信號(hào)通路調(diào)控Hes和Hey家族轉(zhuǎn)錄，共同遏制下游信號(hào)傳導(dǎo)。Hes1是Notch信號(hào)通路的直接靶基因，并被高度表達(dá)在胚胎干細(xì)胞中[11-12]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)加入Notch信號(hào)通路激活劑Jagged-1后，Hes1及SSEA1明顯較加入Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT明顯增多，而造血干/祖細(xì)胞表型基因c-Kit較加入Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT明顯減少。結(jié)果提示在胚胎干細(xì)胞中持續(xù)激活Notch信號(hào)抑制了胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化，而抑制Notch信號(hào)通路促進(jìn)了胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化。這與報(bào)道的[13]維持Notch活性低于特定的閾值后可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化結(jié)果相似。最近研究也表明通過(guò)抑制miR126 / Notch1途徑可促進(jìn)體外小鼠胚體干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化[14]。

綜合Notch受體、該通路下游基因Hes-1的變化及流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)結(jié)果，說(shuō)明DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為造血干/祖細(xì)胞，而Jagged-1激活Notch受體可抑制胚胎干細(xì)胞的分化。提示 Notch信號(hào)通路在調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞向造血干/祖細(xì)胞分化中起重要作用，而這種調(diào)控作用機(jī)制可能主要是激活的Notch信號(hào)通路使Hes-1表達(dá)，Hes-1作為轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)抑制bHLH家族中某種分化誘導(dǎo)因子，使其構(gòu)象發(fā)生變化，阻止其與靶基因結(jié)合，從而使各種前體細(xì)胞維持在未分化的增殖狀態(tài),維持一定的細(xì)胞數(shù)量,確保恰當(dāng)?shù)姆只瘯r(shí)間，但究竟為bHLH家族中何種分化誘導(dǎo)因子，有待下一步的研究。

綜上所述，Jagged-1激活 Notch信號(hào)通路可抑制胚胎干細(xì)胞向造血干/祖細(xì)胞的分化，而DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后則促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向造血干/祖細(xì)胞的分化。從而推斷：Notch信號(hào)通路在調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化為造血干/祖細(xì)胞中起重要作用。