張?zhí)烊?，高文怡，?娟

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)， 新疆 烏魯木齊 830000； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 影像中心,新疆 烏魯木齊 830000)

乳腺癌(breast cancer)是全世界女性最常見的惡性腫瘤[1]。迄今為止乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及病因和發(fā)病機(jī)制尚不全明確。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,在研究乳腺癌基礎(chǔ)中的一些熱點(diǎn)領(lǐng)域值得重視。

賴氨酸去甲基化酶3A (lysine demethylase 3A, KDM3A)是組蛋白脫甲基化酶家族的一個(gè)成員,能特異性地脫甲基化組蛋白H3 Lys-9,因此在組蛋白編碼中起著中心作用[2-3]。KDM3A可以促進(jìn)前列腺癌[4-5]、肝癌[6]的進(jìn)展。目前,國內(nèi)外研究[8]僅發(fā)現(xiàn)KDM3A 通過去甲基化組蛋白和非組蛋白p53在乳腺癌細(xì)胞侵襲和凋亡中起到雙重作用,但其在乳腺癌中發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。本項(xiàng)目組前期實(shí)驗(yàn)證明組蛋白去甲基化酶KDM3A在乳腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織,組蛋白去甲基化酶KDM3A的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān),本研究分析KDM3A基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞系MDA-MB-231增殖和凋亡的影響,旨在為乳腺癌靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；胎牛血清(Life Technologies公司);Trizol? Reagen(Invitrogen公司);M-MLV和dNTPs(Promega公司);Bulge-LoopTMmiRNA和qPCR Primer Set(廣州銳博生物技術(shù)有限公司);DMEM-H培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U)(Gibco公司);CCK8試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司);陰性對照病毒CON077和LV-KDM3A-RNAi慢病毒(上海吉凱基因科技有限公司);Transwell小室(Corning公司);DMSO(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：用含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素的DMEM液體培養(yǎng)體系培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)期。將處于對數(shù)增殖期的MDA-MB-231細(xì)胞,完全培養(yǎng)基制成(3～5)×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液,在96孔板中接種100 μL細(xì)胞懸液。當(dāng)細(xì)胞匯合率為20%～40%時(shí),分別加入KDM3A shRNA-NC、KDM3A shRNA-1、KDM3A shRNA-2、KDM3A shRNA-3病毒進(jìn)行感染,16 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h,用嘌呤霉素進(jìn)行篩選,以未感染慢病毒的正常乳腺癌細(xì)胞系為空白組(blank),以穩(wěn)定表達(dá)陰性對照慢病毒的乳腺癌細(xì)胞株為陰性對照組(NC),以轉(zhuǎn)染KDM3A慢病毒載體的為KDM3A-shRNA組，分別記為KDM3A-sh1、KDM3A-sh2、KDM3A-sh3組。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR所用引物序列表公式計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量：GAPDH的上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。KDM3A的上游引物序列為5′-ACACCGACGTTACCAAGAAGG-3′，下游引物序列為5′-CAGGTGACTTTCGTTCAGCT AA-3′。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖： 取增殖狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的MDA-MB-231細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，用完全培養(yǎng)基分別制備成5×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，接種至96孔板，100 μL/孔，每個(gè)組5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后按2.3實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行感染細(xì)胞，感染24、48和72 h后棄去孔中培養(yǎng)基，每孔加入100 μL培養(yǎng)基總體積10%的CCK8液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育，1 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的A值。

1.2.4 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：感染96 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，加入400 μL annexinV結(jié)合液重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。加入5 μL annexinV-FITC，輕輕混勻，4 ℃避光孵育15 min，再加入10 μL PI 染色液，4 ℃避光放置5 min。在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.5 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲：取狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整濃度為4×105個(gè)/mL；在下室(即24孔板底部)加入600 μL 完全培養(yǎng)基，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，每組3個(gè)重復(fù)孔。4%的甲醛室溫固定20 min，取出小室，結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞凋亡：提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進(jìn)行 SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印到 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶封閉 1 h，一抗 4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育 1 h，用 ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測目的條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 KDM3A干擾的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的建立和鑒定

KDM3A-sh2組干擾效果最佳(P<0.01),相對于NC組基因敲減效率可達(dá)80.1%(圖1),在隨后的實(shí)驗(yàn)中均選擇 KDM3A-sh2組細(xì)胞。

*P<0.01 compared with NC,KDM3A-sh1 and KDM3A-sh3 groups圖1 RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中KDM3A mRNA相對表達(dá)量Fig 1 KDM3A relative mRNA expression levels

2.2 KDM3A沉默抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖

sh-KDM3A組24、48和72 h時(shí)的A值均低于blank組和NC組(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with NC group圖2 沉默KDM3A對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響Fig 2 Effect of silencing KDM3A on proliferation of

2.3 敲除KDM3A促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

sh-KDM3A組細(xì)胞的凋亡率高于NC組和對照組(P<0.05)(圖3)。

A.control; B.negative; C.shRNA-KDM3A; D.apoptosis rate in each group； *P<0.05 compared with control group and negative group圖3 沉默KDM3A對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effect of silencing KDM3A on apoptosis of

2.4 敲除KDM3A后MDA-MB-231細(xì)胞遷移與侵襲能力減弱

與對照組和NC組細(xì)胞比較,sh-KDM3A組細(xì)胞的遷移率顯著下降(P<0.01);sh-KDM3A組細(xì)胞運(yùn)動和侵襲能力顯著低于對照組和NC組(P<0.01)(表1，圖4)。

表1 沉默KDM3A對MDA-MB-231細(xì)胞遷移與侵襲的作用Table 1 Effect of silencing KDM3A on migration and invasion of MDA-MB-231 n=45)

*P<0.01 compared with NC圖4 沉默KDM3A對MDA-MB-231細(xì)胞遷移與侵襲的影響Fig 4 Effects of silencing KDM3A on migration and invasion of MDA-MB-231

3 討論

近年來，KDM3A在腫瘤中的作用及其分子機(jī)制引起了很多學(xué)者的關(guān)注。在前列腺癌中,KDM3A敲除可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖及存活,其可能的分子機(jī)制是KDM3A沉默后c-Myc轉(zhuǎn)錄活性被抑制,并且證實(shí)c-Myc可能是JMJD1A的下游效應(yīng)器[4-5]。本研究證實(shí)沉默KDM3A基因可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)KDM3A在調(diào)節(jié)雄激素受體活性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]，這可能表明KDM3A通過某種機(jī)制介導(dǎo)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性, 從而影響前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。最新研究表明,KDM3A可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞DNA修復(fù)因子的表達(dá)及放射抵抗性[14]。這符合本研究的結(jié)果,即KDM3A表達(dá)下調(diào)可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖。國外研究發(fā)現(xiàn)，KDM3A有助于卵巢癌細(xì)胞的增殖和治療抵抗,該機(jī)制可能與KDM3A介導(dǎo)的Sox2表達(dá)刺激和p53蛋白去甲基化相關(guān)[13]。這與本研究沉默KDM3A后乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力減弱的結(jié)果一致。KDM3A通過降低cyclin D1的表達(dá),促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖,敲除KDM3A可有效抑制乳腺癌干細(xì)胞的致瘤潛能,進(jìn)一步提高對化學(xué)藥物治療的敏感性[15-16]。這些都表明KDM3A在腫瘤細(xì)胞的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,但KDM3A在乳腺癌中的特異性分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231具有較高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,且KDM3A在該細(xì)胞系中高表達(dá),因此選擇本細(xì)胞系進(jìn)行KDM3A敲除實(shí)驗(yàn)。。本研究表明,不同細(xì)胞系中KDM3A mRNA和蛋白表達(dá)水平存在顯著差異,MDA-MB-231細(xì)胞系中KDM3A的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞,提示KDM3A的表達(dá)水平可能與乳腺癌的侵襲能力有關(guān),KDM3A的高表達(dá)提示乳腺癌預(yù)后不良。

綜上所述,KDM3A沉默可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲,因此KDM3A的表達(dá)對乳腺癌的預(yù)后具有重要意義。本研究的局限性主要有兩點(diǎn)，首先該研究屬于體外研究,但乳腺癌的發(fā)生與體內(nèi)環(huán)境密切相關(guān)。其次本研究采用的MDA-MB-231細(xì)胞系屬于三陰性乳腺癌細(xì)胞系，而目前臨床上至少有4個(gè)型別的乳腺癌，如能增加其他乳腺癌細(xì)胞系則更好。另外，如能采用原代三陰性乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證則會使證據(jù)更加充分。