李明陽(yáng)，王淑霞，趙靜苗，王秋萍，陳 憑，金 華，胡繼宏

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院； 2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； 3.科研實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州市第二人民醫(yī)院 體檢中心， 甘肅 蘭州 730000)

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是全球范圍內(nèi)致死的主要疾病之一。急性心梗后的心律失常、心力衰竭是常見(jiàn)合并癥，也是致死的主要原因[1]。傳統(tǒng)的治療方法(如介入治療、溶栓治療、外科治療等)雖然能夠改善疾病狀況，減少死亡，但均不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)壞死的心肌細(xì)胞。為此，干細(xì)胞移植有望成為防止和逆轉(zhuǎn)心力衰竭的一個(gè)有效途徑，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)在許多心臟疾病(如心肌梗死和心肌肥厚)的治療中發(fā)揮著越來(lái)越普遍的作用。BM-MSCs移植可以通過(guò)心肌細(xì)胞的再生以及旁分泌作用促進(jìn)血管生成、減少心肌纖維化、阻止宿主心肌細(xì)胞凋亡來(lái)改善受損的心功能[2]。梗死區(qū)內(nèi)部及梗死周邊區(qū)尚存活的心肌細(xì)胞膜離子通道功能改變，可能是導(dǎo)致梗死后出現(xiàn)心律失常的原因[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs移植對(duì)心肌梗死區(qū)的鉀離子通道蛋白Kv1.5和Kv1.2的表達(dá)有一定影響[4]。5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-Aza)作為BM-MSCs公認(rèn)的定向誘導(dǎo)劑，5-Aza誘導(dǎo)BM-MSCs移植對(duì)鉀離子通道蛋白、炎性因子以及前列環(huán)素的影響尚不清楚。本研究旨在系統(tǒng)探討5-Aza誘導(dǎo)BM-MSCs移植對(duì)心肌鉀離子通道蛋白及心梗相關(guān)細(xì)胞因子(炎性因子、細(xì)胞凋亡因子、自噬因子)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，2月齡，50只，體質(zhì)量(180±22)g，[甘肅中醫(yī)藥大學(xué)許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0005]；大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BM-MSCs第2代(北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：5-氮雜胞苷(Sigma-Aldrich 公司)；Western blot試劑盒(Solarbio公司)；Western blot 一抗(Abcam公司)；Western blot 二抗、beclin-2抗體、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(MSCM)(ScienCell公司)；caspase-3抗體[安諾倫(北京)生物科技有限公司]；IL-3抗體、PGI2抗體(北京索萊寶科技有限公司)； IL-6抗體、TNF抗體(武漢六合生物技術(shù)有限公司)；VEGF抗體(廣州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將分為對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組、BM-MSCs組、5-Aza-BM-MSCs組，每組10只。除對(duì)照組外，均用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎建立心梗模型[5]，模型成功后15～20 min，模型組不注射任何溶液；陰性對(duì)照組注射100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；BM-MSCs組移植等量單純的BM-MSCs(1×106個(gè)/100 μL)；5-Aza-BM-MSCs組在細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合時(shí)進(jìn)性細(xì)胞傳代，加入等量濃度為10 μmol/L的5-Aza誘導(dǎo)24 h，移植時(shí)用1 mL注射器在梗死心肌周?chē)?點(diǎn)注射至心尖部，前期體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5-Aza誘導(dǎo)可分化為心肌樣細(xì)胞[6-7]。

1.2.2 心肌梗死面積的檢測(cè)：取心尖組織以4%多聚甲醛固定，HE染色，采用Image J軟件計(jì)算梗死面積百分比，心肌梗死面積=梗死區(qū)域/總區(qū)域×100%。

1.2.3 免疫組化法檢測(cè)：取心尖組織，檢測(cè)細(xì)胞凋亡因子caspase-3和自噬因子beclin-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF、PGI2和氧化應(yīng)激因子SOD；炎性反應(yīng)因子IL-3、IL-6和TNF-α，利用Image J 軟件定量分析。

1.2.4 Western blot檢測(cè)：取心尖組織，Western blot分別加入Kv1.2、Kv1.5的一抗和二抗，用ECL發(fā)光顯色后，將PVDF膜放入數(shù)碼凝膠圖像分析儀進(jìn)行曝光，所得圖片采用Image J件進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算相應(yīng)的蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積

與對(duì)照組相比，模型組心肌梗死面積增大(P<0.05)；與模型組相比，BM-MSCs組和5-Aza-BM-MSCs組心肌梗死面積均減少，5-Aza-BM-MSCs組較BM-MSCs組明顯減少(P<0.05)(圖1)。

2.2 細(xì)胞凋亡和自噬因子

與對(duì)照組相比，模型組caspase-3和beclin-2的表達(dá)均上升(P<0.05)；與模型組相比，BM-MSCs組和5-Aza-BM-MSCs組caspase-3和beclin-2的表達(dá)降低(P<0.05)；與BM-MSCs組相比，5-Aza-BM-MSCs組的caspase-3表達(dá)降低(P<0.05)(圖1)。

2.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF、PGI2和SOD的表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組VEGF和PGI2表達(dá)上升，而SOD表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組相比，BM-MSCs組和5-Aza-BM-MSCs組VEGF、PGI2和SOD表達(dá)上升(P<0.05)；5-Aza-BM-MSCs組的VEFG和SOD較BM-MSCs組升高(P<0.05)(圖2)。

2.4 炎性細(xì)胞因子IL-3、IL-6和TNF-α表達(dá)結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組的IL-3、IL-6和TNF-α含量表達(dá)上升(P<0.05)；與模型組相比，BM-MSCs組和5-Aza-BM-MSCs組的IL-3、IL-6和TNF-α含量表達(dá)降低(P<0.05)；5-Aza-BM-MSCs組的IL-6較BM-MSCs組表達(dá)降低(P<0.05)(圖3)。

2.5 鉀離子通道蛋白Kv1.2和Kv1.5的表達(dá)結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組的Kv1.2和Kv1.5表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，BM-MSCs組的Kv1.2表達(dá)下降,而5-Aza-BM-MSCs組表達(dá)上升(P<0.05);BM-MSCs組和5-Aza-BM-MSCs組的Kv1.5表達(dá)上升 (P<0.05)。與BM-MSCs組相比，5-Aza-BM-MSCs組的Kv1.2表達(dá)上升(P<0.05)(圖4)。

3 討論

心血管疾病嚴(yán)重影響人類(lèi)健康，根據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告 2018》顯示，中國(guó)心血管病患病率持續(xù)上升，并且病死率居首位。心肌自我再生能力有限，并不足以彌補(bǔ)梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞壞死和丟失。BM-MSCs移植可通過(guò)旁分泌和轉(zhuǎn)分化的方式增加新生血管，提高血管密度，改善心功能，減少心肌梗死面積[2]。5-Aza誘導(dǎo)BM-MSCs更有利于心肌細(xì)胞存活及病理改善。影響梗死面積大小的主要因素是細(xì)胞凋亡，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子和執(zhí)行者。心肌梗死時(shí)，BM-MSCs可抑制caspase-3的表達(dá)降低細(xì)胞凋亡[8]，同時(shí)VEGF 和SOD具有抗凋亡，增強(qiáng)抗氧化，減少心梗面積[9-10]。本研究顯示，BM-MSCs移植不僅抑制caspase-3表達(dá)，且促進(jìn)VEGF和SOD高表達(dá)，這可能是減少心梗面積的重要原因之一。另外，BM-MSCs具有獨(dú)特的免疫抑制和炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)作用，BM-MSCs移植可以降低促炎因子TNF-α和 IL-6 的表達(dá)，改善心臟功能，減小梗死面積[11]。5-Aza誘導(dǎo)BM-MSCs移植也可促進(jìn)IL-6和caspase-3低表達(dá)、VEGF和SOD高表達(dá)，提示5-Aza誘導(dǎo)BM-MSCs可能通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮因子生成，減少炎性反應(yīng)， 抑制細(xì)胞凋亡的表達(dá)，從而減少心梗面積。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group圖1 細(xì)胞移植4周后各組心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡因子caspase-3及細(xì)胞自噬因子beclin-2比較Fig 1 Comparison of myocardial infarct size, cell apoptosis factor caspase-3 and cell autophagy factor beclin-2 in each group 4 weeks after cell transplantation(immunohistochemical, ×200)

心梗后的心律失常最重要機(jī)制是梗死灶、邊緣區(qū)和存活心肌組織共存而引起的電生理異質(zhì)性，同時(shí)氧化應(yīng)激可促進(jìn)心律失常的發(fā)生。鉀離子通道蛋白是維持正常心電活動(dòng)的主要離子通道，與心律失常的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；鉀離子通道蛋白Kv1.5與房性心律失常有關(guān)，也參與細(xì)胞的增殖、凋亡及炎性反應(yīng)等病理過(guò)程[12]， 阻斷Kv1.5通道， 上調(diào)caspase-3表達(dá)，增加SOD活性，可以促進(jìn)BM-MSCs活性[10,12-13]，SOD與TNF-α成負(fù)相關(guān)，TNF-α可降低Kv1.5的表達(dá)，引起心律失常[14]。本研究BM-MSCs移植降低caspase-3和TNF-α表達(dá)，提高SOD和Kv1.5表達(dá)，提示BM-MSCs移植可能通過(guò)caspase-3、 SOD和TNF-α影響Kv1.5的表達(dá)， 而對(duì)Kv1.2表達(dá)下降影響的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究探索。另外，5-Aza誘導(dǎo)可促使部分BM-MSCs分化為表達(dá)延遲整流鉀電流心肌樣細(xì)胞，促進(jìn)鉀離子通道成熟[15]，Kv1.5和Kv1.2均為延遲整流鉀電流， 且Kv1.5 mRNA的表達(dá)不受5-Aza的影響[16]，與本研究結(jié)果類(lèi)似，提示5-Aza誘導(dǎo)BM-MSCs可促進(jìn)Kv1.2高表達(dá)，對(duì)Kv1.5無(wú)影響。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group圖2 干預(yù)4周后各組心肌梗死區(qū)VEGF、PGI2和SOD比較Fig 2 Comparison of VEGF, PGI2, and SOD in myocardial infarction area after 4 weeks of intervention (immunohistochemistry, ×200)

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group圖3 細(xì)胞移植4周后各組炎性因子IL-3、IL-6和TNF-α比較Fig 3 Comparison of inflammatory factors IL-3, IL-6 and TNF-α in each group 4 weeks after cell transplantation (immunohistochemistry, ×200)

綜上所述， BM-MSCs可能通過(guò)caspase-3、 SOD和TNF-α影響Kv1.5的表達(dá)；5-Aza誘導(dǎo)BM-MSCs可通過(guò)促進(jìn)VEGF和SOD，降低IL-6和caspase-3表達(dá)而減少心肌梗死面積，并促進(jìn)Kv1.2高表達(dá)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group圖4 細(xì)胞移植鉀離子通道Kv1.2和Kv1.5蛋白的比較Fig 4 Comparison of Kv1.2 and Kv1.5 proteins of potassium ion channel in cell n=10)