劉其海，謝婉婷，賈振宇，朱小花，王榮輝

（1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州510225；2 湛江博泰生物化工科技實業(yè)有限公司，廣東湛江524051；3 廣東維芊科技有限公司，廣東佛山528216）

結(jié)腸特異性藥物輸送與傳統(tǒng)藥物相比具有許多優(yōu)點。首先，有些藥物容易被胃酸破壞或被胰酶代謝，但不受結(jié)腸影響；其次，結(jié)腸是吸收多肽和蛋白質(zhì)的理想場所，其中的蛋白酶濃度比消化道的其他部分低得多，而且結(jié)腸中的藥物停留時間長，藥物的利用度會顯著增加。因此，結(jié)腸特異性藥物輸送系統(tǒng)越來越受到人們的重視[1?2]。在早期的研究中，結(jié)腸特異性藥物的獲得方式主要依靠時間、壓力或pH 敏感[3?4]。然而，由于藥物的釋放對于個體差異是不可靠的，隨著研究的擴展，細菌引發(fā)的藥物已經(jīng)成為結(jié)腸特異性藥物輸送系統(tǒng)的研究熱點。細菌引發(fā)控制藥物釋放的核心問題是新型材料，其是結(jié)腸特異性藥物發(fā)展的基礎(chǔ)。

偶氮化合物和多糖是用于細菌引發(fā)的分娩系統(tǒng)的兩種主要材料[5?6]。多糖具有良好的無毒、生物降解性和生物相容性，已在多種生物醫(yī)學(xué)系統(tǒng)中得到應(yīng)用。果膠是一種典型的多糖，它被結(jié)腸菌群的果膠溶解酶選擇性降解，但果膠由于溶解性問題，不能獨立作為結(jié)腸特異性載體[7]。為解決這一問題，將殼聚糖結(jié)合果膠，兩者發(fā)生離子反應(yīng)，形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，防止藥物在腸液中釋放和在結(jié)腸中降解。利用果膠?殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合物制成的多種藥物載體，如水凝膠、薄膜、片劑、球粒、珠粒[8?9]等，其優(yōu)良性能得到了研究者的認可。

本文研究殼聚糖結(jié)合果膠、卡拉膠等原料制備了光滑細膩的薄膜材料，并對其制備過程中的影響因素進行了探討。測定了果膠?殼聚糖薄膜的力學(xué)性能（包括拉伸強度和伸長率），對其降解性能進行了表征。為了增加薄膜的形成，添加了植物材料卡拉膠和淀粉，開發(fā)新型膠囊緩釋復(fù)合材料。

1 實驗部分

1.1 薄膜材料的制備

1.1.1 果膠?殼聚糖復(fù)合薄膜的制備

將果膠粉溶解于去離子水中制備果膠溶液（50g/L）；殼聚糖粉在0.3%（體積分數(shù)）乙酸的去離子水中溶解，制備殼聚糖溶液（10g/L）。然后分別將20mL、40mL、60mL、80mL、100mL 果膠溶液中加入100mL 殼聚糖溶液中，用高速剪切機以5000r/min 轉(zhuǎn)速攪拌成凝膠狀，得到不同質(zhì)量比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）的果膠?殼聚糖混合物。然后對每個復(fù)合物進行離心，除去上清液，得到復(fù)合水凝膠。將上述制備的果膠?殼聚糖混合溶膠涂布于玻璃表面皿，在50℃真空條件交聯(lián)反應(yīng)12h。在玻璃表面形成一種柔軟的薄膜，然后將它從玻璃板上剝離，在50℃真空干燥6h，切成試樣。

1.1.2 果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合膜的制備

適當比例的淀粉溶解在去離子水中，攪拌和加熱到70～80℃、5～8min到達凝膠化。然后將卡拉膠粉按一定比例加入到溶液中，激烈攪拌。當粉末完全溶解后，將按1∶1制備的果膠?殼聚糖混合物慢慢地加入到溶液中，不斷攪拌以確保均勻分布。然后，適當補充去離子水，使總濃度達到60～80g/L，加入甘油作為增塑劑。表1列出來制備過程的物料配比。將上述制備的果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合溶膠涂布于玻璃表面皿，在50℃真空條件交聯(lián)反應(yīng)12h，在玻璃表面形成白色或微黃色的薄膜，將它從玻璃板上剝離，在50℃真空干燥6h，切成試樣。

1.1.3 果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合物制備硬膠囊

膠囊是由不銹鋼模制模形成。將果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合物在膠囊模具中進行壓制，脫模后在50℃真空干燥箱干燥12h。最后，形成的膠囊經(jīng)過仔細地脫色、切割、封頂和密封。

表1 樣品制備過程的物料配比

1.2 材料的性能測試

1.2.1 厚度測量

厚度用千分尺在四個角和每個樣品的中間位置測量，測量結(jié)果精確到0.01mm。

1.2.2 抗拉強度和伸長率

拉伸強度（TS）是指材料在拉伸或拉斷前所能承受的最大應(yīng)力，而斷裂時的延伸率（E）是材料原始長度的變化百分比。根據(jù)ASTM 標準方法D882?12 （ASTM， 2012）， 在 紋 理 分 析 儀（EZ Test，島津，日本）上對樣板薄膜進行分析。每個樣本為10cm×2.5cm，條件為45h、25℃和50%相對濕度，在一個恒溫恒濕箱中進行。

1.2.3 體外降解行為

降解試驗的目的是考察制備的樣品是否為結(jié)腸特異性藥物傳遞系統(tǒng)的潛在材料。降解試驗采用《中國藥典》（2010）方法進行。

模擬胃液：將胃蛋白酶1g 分散于100mL 0.01mol/L HCl溶液中（pH=1.5）。

模擬腸液：胰蛋白1g 分散于100mL 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液中（pH=6.8）。

模擬結(jié)腸液：將大鼠盲腸外翻，腸段質(zhì)量30g分散于100mL 0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液中（pH=7.8）。這個步驟是在氮氣條件下進行的，以保持厭氧環(huán)境。

將薄膜樣品切割至20mm，稱重（W0），用模擬流體降解。首先，將樣品浸泡在模擬的胃液中2h（0～2h），然后取出并用蒸餾水清洗。其次，將樣品浸泡在模擬腸液中3h（2～5h），用蒸餾水去除沖洗。最后，將樣品浸泡在模擬結(jié)腸液中7h（5～12h）。薄片在整個處理過程中，樣本保持在37℃，錐形瓶中磁力攪拌（100r/min）。每0.5h樣本移出，清洗用蒸餾水和在50℃真空干燥12h。每個樣品的質(zhì)量在第t0時被精確稱重。因此，用式(1)計算th時樣品的降解率Dt。

式中，Wt為th時樣本的質(zhì)量；W0為樣本的t0時質(zhì)量。

1.2.4 水含量測量

采用《中國藥典》（2010）方法測定膠囊的含水量。準確稱量1g膠囊樣品（W0）。膠囊帽和膠囊主體是分開的，在105℃干燥室和干6h。干燥后，準確稱重（Wd），按式(2)計算含水量。

式中，Wd為干燥后膠囊的質(zhì)量；W0為膠囊的初始質(zhì)量。

1.2.5 脆性測量

采用《中國藥典》（2010）方法測定膠囊的脆性。膠囊被放置在干燥器空腔的硝酸鎂飽和溶液中24h，溫度(25±1)℃，然后進行測試，觀察膠囊破裂情況。

1.2.6 體外釋放配置文件

為考察膠囊的釋放行為，以25mg BSA 為模型藥物。灌服BSA 后，將膠囊密封，置于含模擬胃液的容器中2h 取出，至模擬腸液中3h。然后取下膠囊，浸入模擬結(jié)腸液中9h。在整個試驗過程中，模擬流體維持在37℃水浴中，磁力攪拌速度是100r/min。每0.5h測定一次BSA 的釋放量。在預(yù)定的時間，以5mL 模擬流體為樣本進行采集，加入等量的新鮮模擬流體。

用紫外分光光度計（UV?5100，島津，日本）測定了BSA 的釋放量。以1mg/mL 的BSA 溶液為標準溶液，制備稀釋為0.1mg/mL。采用紫外分光光度計測定吸光度為280mm，繪制標準曲線。然后根據(jù)相應(yīng)的吸光度，得到t 時刻樣品的BAS 含量。試驗選用模擬結(jié)腸液作為空白溶液。根據(jù)式(3)計算BSA釋放率。

式中，Rt為t 時釋放的BSA 累積量，mg；Mi為BSA的初始量（25mg）。

1.2.7 掃描電鏡（SEM）分析

采用真空冷凍干燥法干燥（FD?1PF，通用科技發(fā)展有限公司有限公司，中國）和掃描電子顯微鏡觀察（XL?30 SESM，飛利浦電子有限公司，荷蘭）。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄膜材料制備條件考察

殼聚糖和果膠（兩個化合物的分子結(jié)構(gòu)見圖1）混合時，殼聚糖在溶液中電離出來的聚陽離子（—N）與果膠電離的聚陰離子（—COO?）反應(yīng)形成聚電解質(zhì)配合物，其反應(yīng)途徑是殼聚糖的陽離子氨基與果膠的陰離子羧基之間通過靜電吸引，并發(fā)生羰?氨結(jié)合形成交聯(lián)反應(yīng)獲得三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠體，反應(yīng)式見圖2。這一交聯(lián)聚合過程，產(chǎn)物的特性隨反應(yīng)條件的變化而不同，其與乙酸溶液濃度、果膠、殼聚糖比例和攪拌強度等相關(guān)。

圖1 果膠與殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)

研究選擇質(zhì)量分數(shù)0.3%作為乙酸溶液的濃度，首先考慮低濃度的酸可以在以下步驟中減少洗滌次數(shù)，中性聚合物只需清洗一次即可；其次酸濃度如低于質(zhì)量分數(shù)0.3%時，不能形成良好的稠度和黏度，所制得的聚合物顆粒較大。以聚合物收率作為衡量殼聚糖和果膠在反應(yīng)中的比例的指標，由式(4)計算。

其中，干凝膠質(zhì)量為聚合凝膠經(jīng)洗滌和干燥至恒重后的質(zhì)量，殼聚糖和果膠的質(zhì)量為溶解前的質(zhì)量。表2 列出了果膠?殼聚糖復(fù)合物樣品的組成，以考察其添加情況。

從表2中可以看出，不同的配比中，殼聚糖與果膠的質(zhì)量比約為1∶3 時，樣品收率達到最高，為84.30%。隨后，隨著果膠重量的增加，樣品產(chǎn)率隨著果膠量的增加而降低，原因是果膠過量，未與殼聚糖發(fā)生交聯(lián)的部分被通過離心洗滌去除。另外，如果果膠量不夠，殼聚糖不能充分反應(yīng)也會被去除。

表2 果膠-殼聚糖復(fù)合凝膠的組成

果膠?殼聚糖復(fù)合物的制備過程中，攪拌是一個重要步驟。通過攪拌均勻混合物系，可得到光滑細膩的乳狀液，并與制備膠囊中添加的其他組分均勻混合。此外，在澆鑄和干燥后得到的薄膜致密、無氣泡。這是因為外力的作用可以打破粒子，使它們更小，減少它們之間的間隙。以這種方式獲得的產(chǎn)品更適合制作膠囊。攪拌與不攪拌條件制備的聚合凝膠樣品的外觀形態(tài)及薄膜樣品的掃描形貌如圖3所示。

從圖3看出，攪拌打漿對薄膜材料的表面光滑度產(chǎn)生明顯影響，在不攪拌打漿條件獲得的薄膜材料的表面在外觀形態(tài)上比較粗糙，而經(jīng)過攪拌打漿獲得的薄膜表面光滑細膩。

2.2 膠囊材料的性能考察

圖2 果膠與殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)方程式

圖3 果膠?殼聚糖聚合薄膜材料的外觀形態(tài)及其電鏡掃描圖

制備的果膠?殼聚糖聚合物薄膜、果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合物薄膜和明膠薄膜的膜厚經(jīng)測量，約為0.11mm。拉伸強度（TS）和伸長率（E）是表征薄膜材料力學(xué)性能的參數(shù)。殼聚糖聚合物、殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合物的力學(xué)性能列于表3。結(jié)果顯示，殼聚糖薄膜的TS 和E 與明膠有明顯差異，不宜單獨制備膠囊。當加入適量的卡拉膠和淀粉時，混合物的TS值較高，且與明膠的差別不大。卡拉膠與淀粉的加入主要作用：一是作為薄膜的填充物增加薄膜透明度；二是在高速攪拌下淀粉及卡拉膠各自發(fā)生糊化產(chǎn)生自交聯(lián)作用。二者的共混糊化所形成的液體屬于非牛頓流體，具有假塑性流體增稠、增韌的特性，同時有助于提高體系的的黏度。因此加入適當?shù)牡矸酆涂ɡz混合物體系的斷裂伸長率及拉伸性能皆有所提高?？ɡz、淀粉及果膠?殼聚糖分子之前主要依靠分之間的氫鍵作用緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定體系。因此，殼聚糖/卡拉膠/淀粉的復(fù)合材料有可能用于制備硬膠囊。

表3 不同薄膜材料的力學(xué)性能

將表1中制備的果膠?殼聚糖聚合物膜和果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合膜（樣品1、樣品2、樣品3）分成三等份，并分別依次加入到模擬胃液、模擬腸液、模擬結(jié)腸液環(huán)境中，進行模擬材料在體內(nèi)降解行為的研究。圖4 為果膠?殼聚糖聚合物膜和不同物料配比的果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合膜的降解過程與時間的對應(yīng)關(guān)系。從圖4可看出，在前5h內(nèi)，果膠?殼聚糖聚合物膜不溶于模擬胃液和模擬腸液，但從第6h開始可溶于模擬結(jié)腸液。從第6～7h，模擬結(jié)腸液體中酶和微生物的降解需要一段時間后才能產(chǎn)生溶質(zhì)。果膠?殼聚糖聚合物膜的這一特性表明，它是一種新型的結(jié)腸特異性給藥系統(tǒng)材料，但不能單獨使用，因為在模擬結(jié)腸液中浸泡的前2h 幾乎不溶，這會導(dǎo)致延遲藥物的釋放時間，因此加入卡拉膠和淀粉以提高其溶解度可解決這一問題。此外，卡拉膠還能增加柔韌性和凝膠性，淀粉能增加柔韌性和透明度。

圖4 不同的樣品薄膜樣品在模擬胃液和腸液中的降解率隨時間關(guān)系

通過考察不同物料的配比，果膠?殼聚糖、卡拉膠和淀粉的質(zhì)量比分別為1∶1∶1、2∶1∶1、3∶1∶1，發(fā)現(xiàn)殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合膜的降解是由果膠?殼聚糖聚合物決定的。隨著果膠?殼聚糖的增加，樣品的降解性降低?？ɡz和淀粉耐降解性，在模擬胃液和腸液中它們不能被快速溶解。

按表1配方制備的薄膜材料在模具上壓制形成膠囊樣品，樣品1 薄膜制成膠囊1，樣品2 薄膜制成膠囊2，樣品3 薄膜制成膠囊3，外觀形態(tài)見圖5。從外觀形態(tài)來看，三者都非常相似。三個樣品膠囊的身體長度、帽長度、厚度、身體外徑和帽外徑上限分別為16.51mm、9.72mm、0.11mm、6.58mm和6.88mm。三個樣品膠囊含水量均約為8.80%，脆性基本都為0。

圖5 實驗制備不同物料配比的硬膠囊樣品外觀形態(tài)

圖6 不同膠囊樣品中的BAS的釋放率隨時間關(guān)系

以BSA 為模型藥物，考察膠囊樣品的釋放效果，結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看到，在模擬胃液中，前2h 三個膠囊樣品沒有釋放出BSA。雖然膠囊外層降解，但質(zhì)量損失很小，因此BSA 無法穿透膠囊并釋放。經(jīng)過2h 后，在模擬腸液中，BSA以較低的速率從膠囊中釋放出來。到達5h后，在膠囊樣品中，膠囊1的釋放率達到53.21%，2號膠囊和3 號膠囊的釋放率分別為9.83%和7.52%，這是由于腸液對卡拉膠和淀粉的降解，水通過一些小孔進入膠囊中導(dǎo)致BSA 被水溶解并釋放，在模擬結(jié)腸液中，BSA從膠囊中釋放明顯增加。6h時，1號膠囊釋放率為94.88%，為最高，膠囊2在6h時釋放率為93.84%，膠囊3在7h時釋放率為80.95%。原因是酶和微生物在結(jié)腸液中降解膠囊的混合材料。之后，釋放率降低可能是因為釋放的BSA 也被酶和微生物降解。實驗結(jié)果表明，BSA的釋放與殼聚糖的含量有關(guān)，含量過多導(dǎo)致釋放率低，釋放時間長，含量過少導(dǎo)致腸液的高釋放率，不利于結(jié)腸靶向。因此，2 號膠囊具有良好的結(jié)腸特異性，可作為一種新型的結(jié)腸靶向膠囊材料。圖7為2號膠囊在模擬胃液、模擬腸液和模擬結(jié)腸液中不同浸潤降解時間后的外觀形態(tài)。

3 結(jié)論

圖7 膠囊2經(jīng)模擬胃液和腸液降解后的外觀形態(tài)

通過制備條件和降解行為特性考察，對殼聚糖基復(fù)合聚合物作為膠囊材料進行了研究。在果膠?殼聚糖膜制備過程中，體積分數(shù)0.3%的乙酸、質(zhì)量比（3∶1）和5000r/min 攪拌打漿是制備綜合性能良好薄膜材料的優(yōu)選條件，由此得到的果膠?殼聚糖膜具有光滑細膩的表面和良好的力學(xué)性能。體外模擬降解實驗中，單純果膠?殼聚糖膠囊不溶于模擬胃液和模擬腸液，但可溶于模擬結(jié)腸液。因此，果膠?殼聚糖復(fù)合聚合物可以作為結(jié)腸特異性膠囊的候選材料，但它在結(jié)腸液體中緩慢降解，這不利于膠囊藥物的及時釋放?？ɡz和淀粉的加入增加了薄膜的柔韌性、凝膠性、透明度和力學(xué)性能。果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合物的質(zhì)量比為2∶1∶1 時，制得的膠囊6h 時BSA 釋放率為93.84%，膠囊具有優(yōu)良的性能，因此，果膠?殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合物可以作為結(jié)腸靶向膠囊的新型材料