張龍富，姚家美，蔣冬先，侯英勇，張 新

1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院呼吸科，上海 200031；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，且其發(fā)病率和死亡率仍在上升［1-2］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%，大部分患者首診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)，通常采用以放化療為主的治療手段，5年生存率小于15%［3］。

21世紀(jì)以來(lái)，肺癌的靶向治療和免疫治療取得較大進(jìn)展。多項(xiàng)研究證實(shí)，驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的NSCLC患者使用靶向治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療［4-6］，但突變概率最高的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）只有50%左右［7］。KEYNOTE-042研究顯示，帕博麗珠單抗一線單藥治療驅(qū)動(dòng)基因陰性但程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）陽(yáng)性的NSCLC患者總生存期（overall survival，OS）優(yōu)于傳統(tǒng)化療［8］。但EXPRESS研究結(jié)果顯示，PD-L1＞1%為51.6%，PD-L1＞50%為22.2%［9］。因此有較大部分患者不能從靶向治療和免疫治療中獲益，仍需以化療為一線治療。而且靶向治療或免疫治療的患者耐藥后，化療是延長(zhǎng)生存的重要選擇。含鉑雙藥方案是晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但其療效個(gè)體差異較大，客觀緩解率（objective response rate，ORR）僅為25%～35%，因此早期識(shí)別對(duì)化療有反應(yīng)的人群至關(guān)重要［10-11］。

Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡進(jìn)程中重要的決策者，BIM基因也叫BCL2L11基因，只包含一個(gè)促凋亡的BH3結(jié)構(gòu)域，是調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的重要介質(zhì)［12］。BIM基因的BH3域缺失，容易引起凋亡受阻。Ng等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在EGFR基因突變的NSCLC患者中，BIM基因缺失型使用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的中位無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）比BIM基因野生型短（6.6個(gè)月vs11.9個(gè)月，P=0.027）。Lee等［14］研究發(fā)現(xiàn)，BIM基因多態(tài)性與NSCLC化療效果有相關(guān)趨勢(shì)，BIM基因缺失型患者化療具有更短的中位PFS（3.5個(gè)月vs5.6個(gè)月，P=0.05）。極性蛋白Scribble定位在上皮細(xì)胞頂端部位，Scribble的錯(cuò)位和缺失存在于多種惡性腫瘤中，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥有促進(jìn)作用［15］。Wang等［16］的研究探討Scribble表達(dá)水平與晚期NSCLC含鉑化療效果的相關(guān)性，結(jié)果顯示，Scribble高表達(dá)組的中位PFS明顯優(yōu)于Scribble低表達(dá)組（5.5個(gè)月vs3.6個(gè)月，P=0.012）。

從上述研究可見(jiàn)BIM基因和Scribble均有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，影響NSCLC的化療效果。但單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，BIM基因野生型和Scribble高表達(dá)組的化療PFS與既往研究報(bào)道的4～6個(gè)月相仿。本研究旨在探討B(tài)IM基因多態(tài)性聯(lián)合Scribble表達(dá)水平預(yù)測(cè)晚期NSCLC化療效果的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2014年1月—2015年12月確診的NSCLC患者96例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18歲；② 組織病理學(xué)檢查確診為NSCLC，TNM分期為Ⅲb或Ⅳ期；③所有患者既往均接受過(guò)一線含鉑藥物方案化療，有詳細(xì)的隨訪資料，可以進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，有完善的PFS和OS數(shù)據(jù)，PFS定義為從隨機(jī)化開(kāi)始到腫瘤發(fā)生（任何方面）進(jìn)展或（因任何原因）死亡的時(shí)間，OS定義為從隨機(jī)化開(kāi)始到（因任何原因）死亡的時(shí)間；④ 所有標(biāo)本均應(yīng)是化療前的腫瘤標(biāo)本。

1.2 DNA抽提

手術(shù)標(biāo)本的石蠟包埋組織切取4 μm厚切片5張，活檢標(biāo)本的石蠟包埋組織切取切片10張。DNA抽提采用QIAampDNA FFPE組織試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），實(shí)驗(yàn)步驟參考說(shuō)明書。提取并重懸DNA后經(jīng)NanoDrop 2000（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）檢測(cè)其濃度及純度。

1.3 BIM基因多態(tài)性的檢測(cè)

對(duì)標(biāo)本提取的D N A 行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：BIM基因野生型長(zhǎng)度為216 bp，BIM基因缺失型長(zhǎng)度為173 bp。BIM基因野生型上游引物：5’-ACTGTAAAACGACGGCCAGTCCTC ATGATGAAGGCTAACTCAA-3’；下游引物：5’-ACCAGGAAACAGCTATGACCAACCTCTG ACAAGTGACCACCA-3’；BIM基因缺失型上游引物與BIM野生型一致，下游引物：5’-ACCAG GAAACAGCTATGACCGGCACAGCCTCTATGG AGAACA-3’。PCR條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。4 ℃取出，低溫保存。對(duì)樣本DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步行4%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)觀察DNA條帶的差異鑒別BIM基因多態(tài)性的類型。

1.4 Scribble蛋白水平的檢測(cè)

Scribble蛋白的免疫組織化學(xué)染色方法和Elsum等［17］的研究一致。以腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)著色為基準(zhǔn)，根據(jù)切片中陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及百分比將表達(dá)結(jié)果分為0、1+、2+和3+四個(gè)等級(jí)。0：無(wú)染色或≤10%腫瘤細(xì)胞淺染色；1+：＞10%腫瘤細(xì)胞淺染色；2+：＞10%腫瘤細(xì)胞中度強(qiáng)染色；3+：＞10%腫瘤細(xì)胞強(qiáng)染色。本結(jié)果由3名病理科醫(yī)師各自單獨(dú)評(píng)分，結(jié)果經(jīng)匯總，對(duì)有差異的評(píng)分經(jīng)復(fù)核商討后得到最終一致結(jié)果。0和1+為Scribble低表達(dá)，2+和3+為Scribble高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各亞組間臨床特征以及臨床療效相關(guān)ORR、疾病控制率（disease control rate，DCR）的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法，各亞組間差異比較采用log-rank檢驗(yàn)。多因素分析采用COX回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床特征

共入組96例NSCLC患者，均一線接受含鉑雙藥方案化療。BIM基因缺失型組與BIM基因野生型組之間的各項(xiàng)臨床特征無(wú)差異，Scribble高表達(dá)組的EGFR突變率高于Scribble低表達(dá)組，其他臨床特征無(wú)差異，詳見(jiàn)表1。

表1 患者一般臨床特征Tab.1 General clinical characteristics of the patients

2.2 BIM基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果判定

BIM基因野生型經(jīng)擴(kuò)增后目的片段長(zhǎng)度為216 bp，BIM基因缺失型包括純合型和混合型，純合型為173 bp，混合型為216和173 bp兩個(gè)條帶都有。檢測(cè)結(jié)果顯示，16例（16.7%）患者為BIM基因缺失型，均為混合型；80例（83.3%）患者為BIM基因野生型，部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 BIM基因多態(tài)性與化療效果的關(guān)系

BIM基因野生型組的中位PFS為5.0個(gè)月（95% CI：4.2～5.7個(gè)月），明顯優(yōu)于BIM基因缺失型組的2.7個(gè)月（95% CI：0.7～4.6個(gè)月，P=0.003）。BIM基因野生型組的中位OS與BIM基因缺失型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（11.6個(gè)月vs12.5個(gè)月，P=0.7，圖2）。在ORR方面，BIM基因野生型為41.2%，高于BIM基因缺失型的18.7%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.09）。在DCR方面，BIM基因野生型和BIM基因缺失型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（75%vs56.2%，P=0.223）。

圖1 BIM基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 BIM gene polymorphism detection result diagram

圖2 BIM基因多態(tài)性與化療PFS和OS的關(guān)系Fig.2 Kaplan-Meier curves of PFS and OS to chemotherapy according to BIM gene polymorphism

2.4 Scribble表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，36例（37.5%）患者為Scribble高表達(dá)，60例（62.5%）患者為Scribble低表達(dá)，部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。Scribble高表達(dá)與低表達(dá)組之間EGFR突變狀態(tài)有差異，其他臨床特征無(wú)差異（表1）。Kappa一致性分析顯示，Scribble表達(dá)與BIM基因無(wú)相關(guān)性（Kappa值為0.15，P=0.09）。

2.5 Scribble表達(dá)與化療效果的關(guān)系

Scribble高表達(dá)組的中位PFS為7.0個(gè)月（95%CI：4.9～9.0個(gè)月），優(yōu)于Scribble低表達(dá)組的4.0個(gè)月（95% CI：2.9～5.0個(gè)月，P＜0.001，圖4）。Scribble高表達(dá)組的中位OS為19.5個(gè)月（95%CI：11.4～27.5個(gè)月），也優(yōu)于Scribble低表達(dá)組的9.5個(gè)月（95% CI：8.0～10.9個(gè)月，P=0.001，圖4）。在ORR方面，Scribble高表達(dá)組為52.7%，明顯優(yōu)于Scribble低表達(dá)組的28.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。在DCR方面，Scribble高表達(dá)組和Scribble低表達(dá)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（80.5%vs66.6%，P=0.143）。

圖4 Scribble表達(dá)與化療PFS和OS的關(guān)系Fig.4 Kaplan-Meier curves of PFS and OS to chemotherapy according to Scribble expression

2.6 BIM聯(lián)合Scribble預(yù)測(cè)化療效果

本研究入選的96例患者中，BIM基因野生型且Scribble高表達(dá)（BIM-WT-Scrib-H）組有27例，BIM基因野生型或Scribble高表達(dá)（BIM-WT/Scrib-H）組有62例，BIM基因缺失型且Scribble低表達(dá)（BIM-del-Scrib-L）組有7例。BIM-WTScrib-H組的中位PFS優(yōu)于BIM-WT/Scrib-H組和BIM-del-Scrib-L組（10.0個(gè)月vs4.5個(gè)月vs2.0個(gè)月，P＜0.001，圖5）；BIM-WT-Scrib-H組的中位OS長(zhǎng)于BIM-WT/Scrib-H組和BIM-del-Scrib-L組（24.0個(gè)月vs9.5個(gè)月vs13.3個(gè)月，P=0.001，圖5）。BIM-WT-Scrib-H組的ORR優(yōu)于BIM-WT/Scrib-H組和BIM-del-Scrib-L組（62.9%vs29.0%vs14.3%，P=0.004）；BIM-WT-Scrib-H組的DCR與BIM-WT/Scrib-H組和BIM-del-Scrib-L組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（85.1%vs 69.3%vs42.9%，P=0.066）。

2.7 多因素回歸分析

多因素回歸分析結(jié)果顯示，BIM基因缺失是晚期NSCLC化療具有更短PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（HR=3.221，P＜0.001），Scribble低表達(dá)是晚期NSCLC化療具有更短PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（HR=3.312，P＜0.001）；其余均為非獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。

圖5 BIM聯(lián)合Scribble與化療PFS和OS的關(guān)系Fig.5 Kaplan-Meier curves of PFS and OS to chemotherapy according to BIM polymorphism combined with Scribble expression

表2 多因素分析Tab.2 Multivariate analysis

3 討 論

BIM基因多態(tài)性對(duì)NSCLC的EGFR-TKI療效預(yù)測(cè)價(jià)值已得到證實(shí)，但BIM基因多態(tài)性與晚期NSCLC化療效果的關(guān)系研究較少，結(jié)果存在差異與不足。Lee等［14］的研究通過(guò)多因素分析得出，BIM基因缺失是化療PFS和OS不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。而Zhong等［18］的研究結(jié)果顯示，BIM基因缺失是EGFR突變型NSCLC使用含鉑方案或培美曲塞化療PFS不佳的預(yù)測(cè)因素，但無(wú)法預(yù)測(cè)EGFR野生型患者化療的PFS，也無(wú)法預(yù)測(cè)患者的OS。上述研究均未將一線化療與后線化療分開(kāi)，也存在含鉑雙藥方案與單藥方案混合分析的問(wèn)題。

本研究入組病例不存在化療方案及時(shí)機(jī)的差異，均為一線接受含鉑雙藥化療的晚期NSCLC患者，且臨床基線特征無(wú)差異。結(jié)果顯示，BIM基因缺失型是晚期NSCLC化療PFS不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素；預(yù)測(cè)價(jià)值不受EGFR突變狀態(tài)影響。但BIM基因多態(tài)性不影響患者OS，可能與后線治療差異較大，如放療、免疫治療等，也有可能與病例數(shù)不足有關(guān)。

本研究中Scribble高表達(dá)組的EGFR突變率高于低表達(dá)組，可能與回顧性研究配對(duì)不佳有關(guān)，Scribble表達(dá)與EGFR突變的相關(guān)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Scribble高表達(dá)組的化療PFS、OS及ORR均優(yōu)于低表達(dá)組；且多因素分析顯示，Scribble低表達(dá)是化療預(yù)后不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。上述結(jié)果與Wang等［16］的研究結(jié)果相仿，該研究首次在臨床病例上證實(shí)Scribble與肺癌化療效果的相關(guān)性。但Scribble高表達(dá)組的中位PFS為5.5個(gè)月，較既往研究報(bào)道的NSCLC化療中位PFS無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。因此我們決定探討聯(lián)合多種生物標(biāo)志物提高化療效果預(yù)測(cè)的可行性。

有研究表明，化療是通過(guò)促進(jìn)凋亡來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞［19］，而B(niǎo)IM基因和Scribble蛋白均是參與細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)［12，15］。既往研究表明，BIM可能通過(guò)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響鉑類藥物敏感性［20］，Scribble是通過(guò)調(diào)節(jié)Nox2/ROS和Nrf2/PD-L1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)鉑類藥物敏感性［16］。本研究同時(shí)檢測(cè)BIM基因多態(tài)性和Scribble表達(dá)，并聯(lián)合分析預(yù)測(cè)NSCLC化療效果。

根據(jù)BIM基因和Scribble表達(dá)不同，將入組病例分為3組。其中BIM-WT-Scrib-H組的患者化療PFS、OS及ORR均優(yōu)于BIM-WT/Scrib-H組和BIMdel-Scrib-L組。BIM-WT-Scrib-H組的PFS長(zhǎng)達(dá)10.0個(gè)月，OS為24.0個(gè)月，明顯優(yōu)于BIM基因野生型的PFS（5.0個(gè)月）和OS（11.6個(gè)月），也優(yōu)于Scribble高表達(dá)的PFS（7.0個(gè)月）和OS（19.5個(gè)月）。由此可見(jiàn)，BIM基因和Scribble聯(lián)合分析對(duì)化療預(yù)測(cè)價(jià)值優(yōu)于單個(gè)預(yù)測(cè)因素，而且BIM基因多態(tài)性和Scribble表達(dá)檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，有助于化療個(gè)體化應(yīng)用的開(kāi)展。

總之，BIM基因缺失型和Scribble低表達(dá)是晚期NSCLC化療效果不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素；兩者聯(lián)合應(yīng)用有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值，有利于肺癌的個(gè)體化治療。但本研究為回顧性研究，且樣本量有限，有待進(jìn)一步深入研究提供更高級(jí)別的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。