范守仁，吳淑華，李揚揚，許曉陽，何 雙，溫菲菲，劉 柳，郭寧杰，賈真真

1.濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003；2.濱州市第二人民醫(yī)院病理科，山東 濱州 256800；3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 濱州 256600

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與其所在的微環(huán)境密切相關(guān)，腫瘤免疫微環(huán)境的改變可通過調(diào)控細(xì)胞因子釋放、改變腫瘤血管生成等多種途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等［1］。腫瘤微環(huán)境是由多種細(xì)胞及基質(zhì)等相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)性微生態(tài)系統(tǒng)［2］。其中，免疫細(xì)胞是免疫微環(huán)境中極為重要的部分，免疫細(xì)胞的類型、浸潤位置及密度在很大程度上反映腫瘤的免疫狀態(tài)。在眾多的免疫細(xì)胞中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）及其產(chǎn)物在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，TAM的數(shù)量和功能因腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞的改變而極化為不同的表型，從而發(fā)揮不同作用［3］。因此，有效募集TAM并誘導(dǎo)其向具有抗腫瘤能力的TAM極化有可能成為增強腫瘤免疫的新思路。近期研究表明，自噬在維持腫瘤細(xì)胞能量代謝、促進腫瘤細(xì)胞休眠和免疫逃逸、調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用［4］。本課題組前期研究顯示，結(jié)直腸癌中的自噬水平與腫瘤相關(guān)抗原及周圍淋巴細(xì)胞、CD68陽性巨噬細(xì)胞浸潤量有關(guān)［5］。本研究通過檢測自噬相關(guān)因子LC3、M1型TAM標(biāo)志物CD16及其分泌物IL-1、TNF-α以及M2型TAM標(biāo)志物CD163及其分泌物IL-10、TGF-β的表達(dá)，計數(shù)腫瘤微環(huán)境中CD16+、CD163+、CD68+細(xì)胞及CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞的數(shù)量，探討自噬水平與不同表型TAM及免疫細(xì)胞的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本

收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科及濱州市第二人民醫(yī)院病理科2013年1月—2014年12月存檔的具有完整隨訪資料的結(jié)直腸癌標(biāo)本。入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2019版世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌；首次手術(shù)治療；術(shù)前未進行任何放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前合并潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病或其他炎性腸??；患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病或長期口服免疫抑制劑；術(shù)后30 d內(nèi)死亡及非腫瘤性死亡。每年進行電話或門診隨訪，直至2019年12月或患者死亡，失訪者不予入組。

1.1.2 試劑

LC3、CD16、CD163、CD4、CD8、CD20、CD68、IL-1、IL-10、TNF-α及TGF-β抗體均購自美國Abcam公司，羊抗兔/鼠二抗及免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H-E切片初篩

調(diào)取濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔入選標(biāo)本的所有H-E切片，由兩名資深病理科醫(yī)師采用雙盲法重新閱片診斷。每例患者的腫瘤組織切片為4～6張，選取淋巴細(xì)胞浸潤最多的相應(yīng)石蠟組織進行連續(xù)切片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)

按照免疫組織化學(xué)EnVision法染色：將切片脫蠟至水，高壓熱修復(fù)抗原，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，根據(jù)美國Abcam公司推薦濃度稀釋并加入一抗，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌后加二抗37 ℃溫育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，分化，脫水透明，中性樹膠封片。采用美國Abcam公司提供的陽性組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

LC3主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性標(biāo)志。選取10個陽性細(xì)胞數(shù)最多的高倍鏡視野，根據(jù)細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞比例判定實驗結(jié)果：細(xì)胞無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將兩項評分結(jié)果相乘，≥4分判為陽性。

CD16、CD163及CD68主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，CD4、CD8、CD20主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽性標(biāo)志。IL-1、IL-10、TNF-α及TGF-β表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽性標(biāo)志，腫瘤細(xì)胞陽性不計入陽性細(xì)胞數(shù)。400倍鏡下選取陽性密度最高的5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。計數(shù)高于平均值者為陽性，低于平均值者為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間比較及蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性采用χ2檢驗；蛋白表達(dá)的相關(guān)性用Spearman相關(guān)性分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，并以log-rank法檢驗；采用COX比例風(fēng)險回歸模型進行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌與正常黏膜中各因子的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，自噬相關(guān)因子LC3、M1型TAM標(biāo)志物CD16及M2型TAM標(biāo)志物CD163在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)均高于正常黏膜組織；結(jié)直腸癌組織中CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞及CD68+巨噬細(xì)胞的浸潤量明顯高于正常黏膜，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05，圖1，表1）。

圖1 結(jié)直腸癌中各因子的表達(dá)情況Fig.1 The expression of marker in colorectal cancer

表1 結(jié)直腸癌與正常黏膜中各因子表達(dá)的情況Tab.1 The expression of marker in colorectal cancer and normal tissue

2.2 結(jié)直腸癌中自噬相關(guān)因子LC3與腫瘤微環(huán)境中TAM的數(shù)量及占比的關(guān)系

根據(jù)LC3的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果將結(jié)直腸癌分為LC3+組和LC3-組。結(jié)果顯示，LC3+組中CD16的表達(dá)均高于LC3-組，而CD163在LC3+組中的表達(dá)均低于LC3-組（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，LC3表達(dá)水平與M1型TAM呈正相關(guān)，而與M2型TAM呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05，圖2，表2）。

本研究在L C 3+組及L C 3-組中分別計數(shù)CD68+巨噬細(xì)胞、CD16+M1型TAM、CD163+M2型TAM陽性細(xì)胞數(shù)，計算不同表型TAM在巨噬細(xì)胞中的占比。結(jié)果顯示，LC3+組中M1型TAM在巨噬細(xì)胞中的占比為58.5%（62/106），高于M 2 型TA M（39/106，36.8%），而LC3-組中M1型TAM在巨噬細(xì)胞中的占比為15.1%（11/73），低于M2型TAM（58/73，79.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 結(jié)直腸癌中自噬相關(guān)因子LC3及不同表型TAM的關(guān)系Fig.2 The relationship of LC3 and TAM with different phenotypes in colorectal cancer

表2 結(jié)直腸癌組織中自噬相關(guān)因子LC3與不同表型TAM的相關(guān)性Tab.2 Correlation between LC3 and TAM in colorectal cancer

2.3 結(jié)直腸癌中自噬相關(guān)因子LC3及不同表型TAM與IL-1、TNF-α、IL-10、TGF-β的相關(guān)性

進一步根據(jù)CD16、CD163免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果，將其分為陽性組與陰性組。結(jié)果顯示，LC3+組和CD16+組中IL-1、TNF-α的表達(dá)水平均高于LC3-組和CD16-組，而CD163+組中IL-10、TGF-β的表達(dá)水平高于CD163-組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，LC3、CD16均與IL-1、TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)；CD163則與IL-10、TGF-β的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）；而LC3與IL-10、TGF-β的表達(dá)無顯著相關(guān)性（P＞0.05，表3）。

表3 結(jié)直腸癌中自噬相關(guān)因子LC3、不同表型TAM與其產(chǎn)物的相關(guān)性Tab.3 Correlation of LC3,TAM with different phenotypes and their products in colorectal cancer

2.4 結(jié)直腸癌中不同表型TAM與CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

CD16+組中CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤陽性率高于CD16-組，CD163+組中CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤陽性率低于于CD163-組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表4）。Spearman相關(guān)分析顯示，M1型TAM的表達(dá)與CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤均呈正相關(guān)，而M2型TAM的表達(dá)與CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05，表4）。

表4 結(jié)直腸癌中不同表型TAM與CD4+、CD8+及CD20+淋巴細(xì)胞浸潤的相關(guān)性Tab.4 Correlation of TAM with CD4+,CD8+ and CD20+ lymphocyte infiltration in colorectal cancer

2.5 結(jié)直腸癌中LC3、CD16、CD163的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

LC3、CD16、CD163的表達(dá)與腫瘤直徑、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中LC3與腫瘤直徑呈正相關(guān)，LC3、CD16均與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，CD163與腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表5）。

2.6 LC3、CD16、CD163與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析

133例結(jié)直腸癌患者的中位生存時間為60個月，平均5年生存率為62.11%。Kaplan-Meier分析顯示，LC3、CD16、CD163、TNF-α、IL-1及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與結(jié)直腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05，圖3）。CD163表達(dá)陽性患者5年生存率為34.61%，明顯低于陰性患者（65.51%），而LC3、CD16表達(dá)陽性患者5年生存率分別為65.13%、66.67%，明顯高于陰性患者（29.49%、30.85%，P＜0.05，圖3）。COX回歸模型分析顯示，LC3、CD16、CD163及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05，表6）。

表5 LC3、CD16及CD163的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性Tab.5 Correlation between the expressions of LC3,CD16 and CD163 and clinicopathological features in colorectal cancer

圖3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后生存曲線Fig.3 Survival curve in colorectal cancer patients

表6 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后多因素生存分析Tab.6 Multivariate analysis of prognosis in patients with colorectal cancer

3 討 論

TAM是腫瘤局部免疫微環(huán)境的重要組成成分，是一種平均壽命短且不能在腫瘤組織中增殖的細(xì)胞，需在腫瘤生長和進展過程中持續(xù)募集補充［3］。TAM具有極化不穩(wěn)定性，能被腫瘤細(xì)胞募集、調(diào)控而極化為不同表型。TAM的前體細(xì)胞為腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞，經(jīng)不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)極化為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞（M1型）和替代性活化的巨噬細(xì)胞（M2型）。M1型TAM負(fù)責(zé)提呈腫瘤特異性抗原，同時增強抗腫瘤免疫反應(yīng)［6］，而M2型TAM抗原提呈能力較弱，并可通過多種途徑促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。Zhou等［8］的研究證明，降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的M2型TAM表達(dá)，可抑制腫瘤生長。近年來多項研究表明，結(jié)直腸癌中M2型TAM明顯增高，預(yù)后較差，在結(jié)腸癌細(xì)胞株中誘導(dǎo)TAM向M1型極化從而發(fā)揮抗癌作用［9-10］。本研究顯示，結(jié)直腸癌中TAM的浸潤量高于正常黏膜組織，其中M2型TAM的浸潤量高于M1型TAM，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，而M1型TAM的高表達(dá)有利于患者預(yù)后。這與既往的研究一致，提示結(jié)直腸癌中的TAM以M2型極化為主，不同表型TAM在腫瘤中的浸潤量可能成為影響患者預(yù)后的危險因素。然而，有關(guān)腫瘤細(xì)胞及周圍微環(huán)境對TAM極化的影響及其效應(yīng)尚缺乏進一步研究。因此，深入研究影響TAM極化的相關(guān)因素，有效募集巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化，可能成為增強腫瘤免疫及腫瘤靶向治療的新途徑。

近期有研究表明，M1型與M2型TAM之間可相互轉(zhuǎn)化［11-12］。而激活PI3K/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促進巨噬細(xì)胞向M2型極化，抑制PI3K/mTOR通路則致使其向M1型極化［13-14］。眾所周知，PI3K/mTOR是細(xì)胞生長增殖的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也是調(diào)控自噬的主要通路［15］。自噬是廣泛發(fā)生于真核細(xì)胞內(nèi)的重要生物學(xué)現(xiàn)象，近年來研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌［16］、肺癌［17］及子宮內(nèi)膜癌［18］等多種實體腫瘤中存在自噬的異常激活現(xiàn)象。本課題組的前期研究表明，結(jié)直腸癌中的自噬水平不僅與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也與腫瘤相關(guān)抗原及周圍CD4+、CD8+、CD68+淋巴細(xì)胞浸潤量有關(guān)［5，19］。由此可見，在腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境（如基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞）中自噬的作用極其復(fù)雜。然而，有關(guān)腫瘤自噬水平與腫瘤微環(huán)境中不同免疫表型TAM的關(guān)系，尤其是對巨噬細(xì)胞極化的影響報道罕見。本研究結(jié)果顯示，LC3+組中M1型TAM的數(shù)量高于M2型TAM，而在LC3-組中，M1型TAM的數(shù)量低于M2型TAM。同時，本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌的自噬水平不同，不同表型的TAM占比不同，提示腫瘤自噬水平與TAM的極化具有相關(guān)性。結(jié)合前期研究我們推測，結(jié)直腸癌自噬水平的升高，可引起腫瘤細(xì)胞表面及周圍微環(huán)境中抗原物質(zhì)的增加，進而招募巨噬細(xì)胞聚集并向M1型TAM極化，參與抗原提呈，募集淋巴細(xì)胞，以增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時，本實驗中LC3+組中M1型TAM所占巨噬細(xì)胞比例高于M2型TAM所占比例的結(jié)果提示，自噬異常激活時可引起M2型向M1型TAM的再極化，使腫瘤微環(huán)境中M1型TAM所占巨噬細(xì)胞比例升高，從而進一步增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，結(jié)直腸癌的自噬水平及腫瘤微環(huán)境中不同極化表型的TAM占比，在一定程度上影響患者的預(yù)后。積極促進腫瘤微環(huán)境中TAM向M1型極化、募集和再極化，對于增強腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤進展可能具有重要的臨床意義。

腫瘤免疫包括機體對腫瘤的非特異性免疫和特異性免疫兩方面，其中細(xì)胞免疫是腫瘤特異性免疫的重要部分。T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等對腫瘤細(xì)胞均具殺傷作用，其主要通過所產(chǎn)生的細(xì)胞因子發(fā)揮作用。研究表明，M1型TAM高表達(dá)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，提呈抗原的同時可分泌促炎因子，如IL-1、IL-12、IL-23、TNF-α等細(xì)胞因子，進而促進抗腫瘤免疫［7，20］。Wu等［21］研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β參與乳腺癌抗腫瘤免疫反應(yīng)，并抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。Ray等［22］的研究表明，IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生參與小鼠結(jié)直腸癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。M2型TAM則可釋放TGF-β、IL-10等免疫抑制因子，通過抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖，參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸［23］。Martínez-Campos等［24］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中TGF-β、IL-10高表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞中的MHC-Ⅰ類抗原，并降低細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。然而，有關(guān)腫瘤微環(huán)境中自噬水平改變能否影響不同表型TAM所產(chǎn)生的細(xì)胞因子及其效應(yīng)尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌中LC3的表達(dá)水平及M1型TAM均與IL-1、TNF-α及CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，M2型TAM則與其分泌產(chǎn)物IL-10、TGF-β呈正相關(guān)，而與淋巴細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)。提示結(jié)直腸癌中自噬水平不僅可影響不同表型TAM的極化，同時可影響其分泌產(chǎn)物的表達(dá)，在腫瘤特異性免疫方面發(fā)揮重要作用。推測異常激活的自噬不僅可增加M1型TAM的極化及抗原提呈能力，同時其產(chǎn)物IL-1及TNF-α可刺激CD4+、CD8+T細(xì)胞活化，促進CD20+B細(xì)胞增殖和分泌抗體，增強抗腫瘤的細(xì)胞免疫作用。反之，低水平自噬環(huán)境中，M2型TAM增加，其分泌產(chǎn)物IL-10及TGF-β則可抑制細(xì)胞免疫功能，促進腫瘤免疫逃逸。因此，有效地調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬水平可能成為激活腫瘤免疫反應(yīng)的新途徑。

近年來，TAM與腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系成為新的關(guān)注點。Chen等［25］的研究表明，腫瘤組織中M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)胰腺癌患者較低表達(dá)患者的生存率更低。Qiu等［26］的研究表明，乳腺腫瘤中M2型TAM高浸潤量與患者預(yù)后不良相關(guān)，其可能的機制是由于M2型TAM抑制CD8+T細(xì)胞功能、降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進血管生成并抑制吞噬功能。M2型TAM高表達(dá)還與腫瘤耐藥及預(yù)后不良相關(guān)［27］。本研究結(jié)果顯示，LC3、CD16、CD163的表達(dá)與腫瘤直徑、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kaplan-Meier及COX回歸模型分析表明，LC3、CD16及CD163是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立危險因素。提示結(jié)直腸癌中自噬活性改變了腫瘤相關(guān)巨噬的極化狀態(tài)，促進了M1型TAM的募集，可增加對腫瘤性抗原的提呈作用，同時促進其分泌IL-1、TNF-α等促炎因子，進而誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞聚集，誘發(fā)抗腫瘤免疫效應(yīng)，在一定程度上抑制腫瘤的進展，延長腫瘤患者存活時間。而M2型TAM大量聚集則促進腫瘤免疫逃逸，影響患者預(yù)后。因此，檢測結(jié)直腸癌中自噬相關(guān)因子及不同表型TAM標(biāo)志物對判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要參考價值，可作為評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

總之，結(jié)直腸癌中過度自噬可引起腫瘤微環(huán)境內(nèi)抗原物質(zhì)的增加，進而引起巨噬細(xì)胞募集并向M1型TAM極化，從而誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞浸潤以增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時過度自噬可減少M2型TAM極化，進一步避免腫瘤免疫逃逸，以增強抗腫瘤免疫治療的效果。因此，深入研究自噬水平的改變與不同表型TAM的相關(guān)性及其分子機制，對于判斷腫瘤預(yù)后以及探索結(jié)直腸癌免疫治療新靶點具有重要意義。然而，本研究僅對各因子蛋白水平的變化及相關(guān)性進行了初步探討，仍需增加樣本量并進一步開展體外實驗及動物實驗，以揭示其功能及分子機制。