王翠翠，馬曉欣

子宮內(nèi)膜癌(endometiral cancer, EC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，早期EC預后較好，5年生存率能達到90%以上，然而，Ⅲ期、Ⅳ期EC患者5年生存率僅有60%、20%[1]。促紅細胞生成素的肝癌細胞(erythropoietin-producing hepatomocellular, Eph)受體根據(jù)序列同源性及相應配體肝配蛋白親和性不同分為A(EphA1-10)、B(EphB1-6)兩大類。近年來，越來越多的研究[2-3]表明EphB2作為家族成員之一和配體一起可以調(diào)節(jié)細胞的許多功能，包括增殖、自噬、凋亡、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，雖然有研究[4-6]報道EphB2在很多惡性腫瘤中，與正常組織相比表達有差異，但其與EC的關系尚無研究。該文基于TCGA探討EPHB2的表達與EC患者預后關系，并利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)進一步了解那些既涉及EPHB2調(diào)控網(wǎng)絡又參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展的可能的生物學通路。

1 材料與方法

1.1 材料從TCGA官網(wǎng)(https：//cancergenome.nih.gov/)下載子宮內(nèi)膜癌(UCEC)校正后的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)575例和臨床樣本數(shù)據(jù)548例。EPHB2在23例正常的子宮內(nèi)膜組織及552例EC組織間的表達差異通過散點圖表現(xiàn)。再比較EPHB2在不同臨床病理參數(shù)間的表達情況。最后利用校正后的基因表達數(shù)據(jù)和相應的臨床樣本數(shù)據(jù)做單因素及多因素分析及GSEA。

1.2 方法GSEA是一種基于Java平臺利用電腦計算方法分析一種或一組預先定義的基因在兩種不同生物狀態(tài)之間差異是否有統(tǒng)計學意義。該文中GSEA以所有基因與EPHB2表達的相關性生成的有序的基因列表為基礎，并以EPHB2在EC中的表達水平作為標簽，分成高表達組及低表達組，闡明EPHB2高表達組與低表達組之間是否存在生存差異。每個分析行1 000次基因組排列。以歸一化評分對各表型中富集的途徑前后排序。

1.3 統(tǒng)計學處理計量資料進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，對于單變量兩組資料之間的比較采用t檢驗，否則采用Wilcoxon兩樣本比較檢驗。對于多組資料之間的比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用方差分析，否則采用Kruskal-Wallis檢驗。按EPHB2表達的中位值將其分為高表達組及低表達組,Logistic回歸分析EPHB2的表達與臨床病理特征的關系。Kaplan-Meier法做生存分析曲線。Cox單因素及多因素分析預測EPHB2表達以及其它一些臨床特征(如分期、分級、腫瘤狀態(tài)、組織學類型、淋巴結轉(zhuǎn)移情況、手術方式、是否有殘留病灶及腹水細胞學等)對預后的影響。所有統(tǒng)計分析均用R語言執(zhí)行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者特征從TCGA官網(wǎng)上下載同時具有校正后基因轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)的EC樣本共548例，具體臨床資料信息見表1。

表1 TCGA EC患者的臨床特征

2.2 EPHB2的表達與臨床病理參數(shù)的關系575例來自TCGA數(shù)據(jù)庫中與子宮內(nèi)膜相關的基因表達數(shù)據(jù)中，正常內(nèi)膜組織樣本23例，子宮內(nèi)膜惡性腫瘤樣本552例，子宮內(nèi)膜惡性腫瘤樣本中EPHB2的表達量高于正常的子宮內(nèi)膜樣本(圖1)。在552例內(nèi)膜癌組織樣本中，有548例同時具有基因表達數(shù)據(jù)及患者臨床資料。結果顯示EPHB2表達量與EC期別、分化程度、腹水中是否查到瘤細胞及組織類型等有關，對于高期別、高級別、腹水細胞學陽性及組織病理類型為漿液性腺癌的患者，EPHB2表達量增高(圖2) 。

單因素分析也表明EPHB2的表達與一些關鍵臨床特征有關，而這些臨床特征往往預示著患者的不良預后(表2)。EPHB2高表達組與EC晚期，高級別EC，攜瘤狀態(tài)，腹水找到瘤細胞及較差的組織學類型有關(P<0.05),說明相比于EPHB2表達減低，EPHB2表達增高更有可能出現(xiàn)不良預后。

圖1 EPHB2基因表達情況

表2 EPHB2的表達與臨床病理特征的關系

2.3 生存結局和多因素分析Kaplan-Meier結果顯示EPHB2高表達組的總生存時間低于EPHB2低表達組(P<0.000 1)(見圖2 F)。Cox單因素分析結果顯示EPHB2表達水平與不良生存結局有關。其他可能影響生存預后的因素還包括腫瘤期別、分化程度、是否攜帶腫瘤、腹水中是否可見腫瘤細胞，淋巴結轉(zhuǎn)移情況以及組織病理類型等。并且多因素分析還提示EPHB2可能是一個與總體生存相關的獨立預后因子(表3)。

2.4 GSEA確定的與EPHB2相關的信號通路為明確EPHB2可能參與在影響子宮內(nèi)膜癌進展的哪些通路，設EPHB2的表達水平為表型，分為高表達組及低表達組。以MSigDB數(shù)據(jù)庫中c2.cp.kegg.v5.2.symbols. gmt 數(shù)據(jù)集作為功能基因集，按歸一化富集分數(shù)(NES)排序，在兩組中找到FDR-q值<0.05且FWER-P值<0.05的通路。結果表明EPHB2高表達組主要富集在軸突導向通路中，EPHB2低表達組主要富集在α亞麻酸代謝通路中(圖3)。

圖2 EPHB2的表達與臨床病理特征的關系

表3 EPHB2的表達與EC總生存率關系的單因素與多因素分析

圖3 EPHB2 基因高表達樣本相關富集基因集

3 討論

本文基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床資料進行生物信息學分析，表明EC中EPHB2的表達與部分臨床性狀有關(如腫瘤分期、分級、腹水中是否找到瘤細胞以及腫瘤組織類型等)。晚期、高級別、腹水中見瘤細胞及較差的病理類型與EPHB2高表達有相關性，提示EPHB2表達增高可能與EC的不良預后相關；通過Kaplan-Meier生存分析及Cox單因素及多因素分析證實了這一推測，且EPHB2的表達可能成為一個獨立預測不良結局的因素。為了進一步討論EPHB2影響EC患者預后的機制，又完成了GSEA分析，結果顯示EPHB2表達水平的變化可能通過參與軸突導向通路及α亞麻酸代謝通路而影響EC的預后。

Eph受體是酪氨酸激酶受體亞家族成員，最先發(fā)現(xiàn)是作為神經(jīng)系統(tǒng)細胞間相互作用的調(diào)節(jié)因子，包括軸突導向和神經(jīng)生長錐的發(fā)育。本文利用GSEA也推測EPHB2表達增高可能促進軸突導向通路?；蚯贸竽Ｐ脱芯縖7]發(fā)現(xiàn)EPHB2和肝配蛋白B2在動靜脈的血管內(nèi)皮細胞相互結合，啟動EPHB-肝配蛋白B信號通路，從而調(diào)節(jié)血管及淋巴管的發(fā)育，而且肝配蛋白的反向信號通路還在腫瘤的血管生成中起重要的作用。除了腫瘤的血管新生，EPHB2-肝配蛋白信號通路還可以介導腫瘤的增殖[8]、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3]、侵襲[9]和凋亡等。有學者[10]利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的頭頸部鱗狀細胞癌患者的臨床數(shù)據(jù)，通過Kaplan-Meier生存分析得出EPHB2過表達可降低患者的生存期，其他學者[11]在肺腺癌中也得到相同的結論。在EC中，尚無人指出EPHB2的表達對EC的影響，本文首次利用TCGA數(shù)據(jù)庫總結出EPHB2在EC中表達增高，差異有統(tǒng)計學意義，且EPHB2高表達與很多臨床病理參數(shù)相關，EPHB2表達量越高，EC患者的預后越差。

α亞麻酸是人類及其它高等動物自身無法合成的必須脂肪酸，在人體中，這種脂肪酸可以產(chǎn)生花生四烯酸(ARA)，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，這些物質(zhì)可調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)，高水平的α亞麻酸可幫助預防炎癥性疾病、腫瘤、心血管疾病或其它慢性病[12-13]。α亞麻酸抑制腫瘤發(fā)生的具體機制還不明確。本文通過GSEA得出高表達EPHB2可能通過抑制α亞麻酸代謝促進EC的發(fā)生，具體機制還需要細胞學分子水平上的進一步研究。

軸突導向是指軸突延伸到指定靶點的過程，在神經(jīng)系統(tǒng)中，軸突之所以能沿著精確的路徑生長是由于軸突導向作用在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中有著非常重要的作用。在軸突生長的尖端，有一種活力很高的結構，即生長錐，其上含有能識別導向的受體，并激活各種信號分子調(diào)節(jié)細胞骨架[14]。起初認為軸突導向分子是用來調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元細胞的生長和定位，然而近年來發(fā)現(xiàn)它在腫瘤發(fā)展中也起到重要的作用。具有代表性的是Slits家族，通過與Robo跨膜受體結合激活Slit-Robo信號通路改變腫瘤的遷移、侵襲和增殖等生物學行為[15]。本研究顯示在GSEA中EC EPHB2高表達組富集在軸突導向通路中，它可能通過改變軸突導向相關蛋白的表達影響EC的發(fā)生和發(fā)展。

綜上，EPHB2的表達水平可能成為預測EC不良預后結局的分子標志物，軸突導向和α亞麻酸代謝通路可能是EPHB2起作用的關鍵通路。本文不足在于，結論僅基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，用轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)預測蛋白表達量還不夠準確，且只用GSEA推斷EC中與EPHB2可能相關的通路有一定的局限性，后續(xù)還需要實驗進一步驗證。