趙旭旭，趙衛(wèi)東，張璟鶴，陳崢崢,任萍萍，張 影，葛 麗，于明月，朱美玲

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是婦科常見的慢性、炎癥性、雌激素依賴性疾病，是導(dǎo)致育齡期女性出現(xiàn)盆腔疼痛、月經(jīng)紊亂、組織粘連和不孕的主要原因[1]。其在育齡期女性中的發(fā)病率為5%～10%，困擾著全世界約1.76億女性[2]。內(nèi)異癥確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，缺乏特異性的治療藥物。被廣泛接受的“經(jīng)血逆流學(xué)說”認(rèn)為有活性的子宮內(nèi)膜組織可隨逆流經(jīng)血進(jìn)入盆腔，然后種植，形成內(nèi)異癥。但經(jīng)血逆流可發(fā)生在超過90%的輸卵管未閉的月經(jīng)來潮女性中,而僅約10%的女性發(fā)病。鑒于異位內(nèi)膜與正常內(nèi)膜組織具有相似的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成，因此異位內(nèi)膜細(xì)胞自身特性的改變可能是發(fā)病的重要原因。該研究旨在檢測正常內(nèi)膜和卵巢內(nèi)異癥的異位內(nèi)膜兩組基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，比較兩組細(xì)胞的基因表達(dá)差異，分析介導(dǎo)疾病的主要通路和功能，篩選致病的關(guān)鍵基因和潛在生物標(biāo)志物，并尋找候選的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 病例資料2018年10月—2019年5月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，因卵巢內(nèi)異癥行卵巢囊腫剝除手術(shù)的8例女性患者。對照組的正常內(nèi)膜組織取自行子宮肌瘤手術(shù)的3例患者。選取的內(nèi)膜組織均為晚期分泌期(最接近反流性子宮內(nèi)膜)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①22～43(33.7±6.2)歲；②未絕經(jīng)，平素月經(jīng)規(guī)律；③無子宮內(nèi)膜炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①吸煙者；②有宮內(nèi)節(jié)育器、慢性或免疫性疾病、凝血功能障礙和深靜脈血栓病史；③術(shù)前6個月內(nèi)接受過抗感染、免疫抑制治療，激素治療或抗凝血劑等治療?；颊叩囊话闩R床資料見表1。所有的病理結(jié)果均由兩位副主任病理醫(yī)師共同診斷。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院倫理委員會審核通過(2019-ky066)，并取得所有患者及其家屬的知情同意。

表1 入組患者的臨床資料

1.2 主要儀器及試劑DMEM/F-12購自美國Hyclone公司；FBS購自美國Gibco公司；Ⅳ型膠原酶和Ⅰ型脫氧核糖核酸酶購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B購自北京索萊寶科技有限公司；CD10抗體購自美國BD公司(PE/555375)；磁珠分選試劑盒和LS分離柱購自德國Miltenyi公司。

1.3 分離基質(zhì)細(xì)胞分離基質(zhì)細(xì)胞步驟如下：①無菌條件下采集的新鮮正常內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織，置于冰浴的含10%FBS及三抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素0.1 mg/ml，兩性霉素B 0.25 μg/ml)的DMEM/F-12培養(yǎng)液中，至實驗室分離；② 1×PBS洗3次，剪碎至直徑小于1 mm；③轉(zhuǎn)至含2.5 mg/ml的Ⅳ型膠原酶和50 U/ml的Ⅰ型脫氧核糖核酸酶的DMEM/F-12消化液中混勻，37 ℃消化40 min；④經(jīng)100目篩網(wǎng)濾除未消化的組織,600 r/min、4 ℃離心10 min，去除混雜的白細(xì)胞和紅細(xì)胞； ⑤1×PBS沖洗基質(zhì)細(xì)胞，重懸備用。

1.4 磁珠分選CD10陽性基質(zhì)細(xì)胞磁珠分選CD10陽性基質(zhì)細(xì)胞步驟如下：①對基質(zhì)細(xì)胞離心計數(shù)，以40 μl/107個細(xì)胞的比例加入MACS buffer重懸；②吹勻懸液，以10 μl /107個細(xì)胞的比例加入10 μl CD10 biotin-antibody cocktail，混勻，4 ℃避光標(biāo)記20 min；③MACS buffer洗1次，4 ℃離心；④以70 μl/107個細(xì)胞的比例加入MACS buffer重懸細(xì)胞，以20 μl/107個細(xì)胞的比例加入microbeads cocktail，4 ℃避光標(biāo)記20 min；⑤加入MACS buffer洗1次，4 ℃離心；⑥MACS buffer重懸，過LS柱子；⑦用MACS buffer沖洗掛柱細(xì)胞，4 ℃離心，得到純化的CD10陽性基質(zhì)細(xì)胞。

1.5 基因芯片數(shù)據(jù)的下載和處理純化的基質(zhì)細(xì)胞，利用GPL6480(G4112F; Agilent)平臺檢測其全基因組表達(dá)譜。從基因表達(dá)譜綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)篩得基于同平臺檢測分泌期正常內(nèi)膜和異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的GSE120103和GSE3783兩組芯片，補(bǔ)充9個正常內(nèi)膜組織(GSM3393491-GSM3393499)和14個異位內(nèi)膜組織(GSM3393500-GSM3393508，GSM928792，GSM928800，GSM928806，GSM928808，GSM928810)。依次用Robust Multiarray Average和sva package對3組芯片的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理并消除批次差異，得到歸一化的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。采用limma軟件包和經(jīng)驗貝葉斯方法篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)，其中P<0.05，|log2Fold-change|≥1.0的基因被認(rèn)為表達(dá)顯著差異。芯片數(shù)據(jù)可從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取(GSE132464)。

1.6 差異基因的功能富集分析結(jié)合基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫，利用clusterprofiler軟件包對DEGs富集通路和功能進(jìn)行分析和可視化展示。符合錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05且P<0.05的條件，被認(rèn)為是差異有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著富集。

1.7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將差異基因提交到在線數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/)，得到PPI數(shù)據(jù)。選擇綜合得分>0.7的PPI節(jié)點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用生物信息學(xué)軟件Cytoscape v3.4.0(http://www.cytoscape.org/)分析候選蛋白的交互關(guān)系，對各節(jié)點蛋白相互作用蛋白數(shù)目進(jìn)行排序，篩選出核心靶點。

1.8 類藥物小分子化合物的篩選將差異基因分為上、下調(diào)兩組，分別輸入關(guān)聯(lián)性圖譜(CMAP, http://www.broadinstitute.org/cMAP/)數(shù)據(jù)庫檢索。比較差異基因與CMAP中小分子干擾基因的表達(dá)模式相似性，識別出與疾病相關(guān)的小分子化合物。P<0.001且mean絕對值>0.5的小分子被認(rèn)為與疾病顯著相關(guān)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)和做圖。所有的數(shù)據(jù)均使用雙尾非配對t檢驗進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜組織中DEGs的篩選為篩選異位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜組織中DEGs，以P<0.05，|log2Fold-change|≥1.0為條件，對25個樣本(10個正常內(nèi)膜、15個異位內(nèi)膜)中18 690個基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。共篩得869(4.6%)個差異表達(dá)基因，包括17個上調(diào)基因和852個下調(diào)基因。見圖1A。利用R語言gplots包對差異基因進(jìn)行聚類分析并可視化。見圖1B。

2.2 異位內(nèi)膜組織中DEGs的功能注釋和通路富集為探究異位內(nèi)膜組織中差異基因的功能，對其進(jìn)行GO和KEGG功能注釋。GO富集分析顯示前10位變化條目包括受體配體活性、通道活性、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性和RNA聚合酶Ⅱ特異性、底物特異性通道活性、離子通道活性、離子門控通道活性、門控通道活性、細(xì)胞因子活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性。見圖2A。其中，僅DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性和RNA聚合酶Ⅱ特異性在病灶中被上調(diào)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、IL-17信號通路、破骨細(xì)胞分化通路、金黃色葡萄球菌感染通路、尼古丁成癮通路出現(xiàn)功能紊亂。見圖2B。結(jié)果表明異位內(nèi)膜組織可能通過這些顯著富集的功能條目和通路機(jī)制參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。

2.3 異位內(nèi)膜組織中差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為深入挖掘異位內(nèi)膜組織中核心的致病基因和潛在的生物標(biāo)志物，將全部差異基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。見圖3A。根據(jù)各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的度(degree，表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連路線的條數(shù))篩選出與其他節(jié)點蛋白相關(guān)性最強(qiáng)的8個核心基因，包括甲酰肽受體2(formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2)、血清淀粉樣蛋白A1(serum amyloid A1，SAA1)、松弛肽3(relaxin-3，RLN3)、細(xì)胞介素8(C-X-C motif chemokine 8，CXCL8/IL8)、甲酸基肽受體1(formyl peptide receptor 1，F(xiàn)PR1)、血小板因子4(platlet factor 4，PF4)、趨化因子受體7(C-C chemo-kine receptor type 7，CCR7)和趨化因子配體5(C-X-C motif chemokine 5，CXCL5)基因。與其相互作用的關(guān)系對和基因如表2所示。利用小提琴圖比較8個關(guān)鍵基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示它們在異位病灶中均下調(diào)，以FPR2、SAA1和CXCL8基因的下調(diào)最顯著(t=3.537、P=0.001 8；t=2.995、P=0.006 5；t=2.187、P=0.039 2；t=3.020、P=0.006 1；t=2.256、P=0.033 9；t=2.775、P=0.010 8；t=2.178、P=0.039 9；t=2.258、P=0.0337)。見圖3B。這些核心基因可能在異位內(nèi)膜病灶的形成中起關(guān)鍵作用，有望成為內(nèi)異癥潛在的生物標(biāo)志物。

圖1 差異基因的篩選和聚類分析

圖2 差異基因的功能注釋和通路富集分析

2.4 與內(nèi)異癥疾病相關(guān)的類藥物小分子的篩選為尋找治療內(nèi)異癥的候選藥物小分子，并為進(jìn)一步實驗驗證提供理論依據(jù)，將異位內(nèi)膜組織的差異基因表達(dá)譜與CMAP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。包括Prestwick-692、硫代羅寧、氟硝利嗪、苯海索和喹吡羅在內(nèi)的5個小分子化合物與內(nèi)異癥的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)(表3)。其中，硫代羅寧和氟硝利嗪與病灶中的差異基因具有相反的作用機(jī)制，是拮抗內(nèi)異癥的潛在小分子化合物。而Prestwick-692、苯海索和喹吡羅與內(nèi)異癥某些生物過程或狀態(tài)有相似的關(guān)系，與發(fā)病可能有類似的作用機(jī)制。硫代羅寧和氟硝利嗪的化學(xué)分子式、作用機(jī)制和臨床應(yīng)用見表4。

圖3 核心差異基因的篩選及表達(dá)差異分析

表3 CMAP數(shù)據(jù)庫篩選出的關(guān)聯(lián)度最強(qiáng)的5種小分子化合物

表4 負(fù)相關(guān)小分子化合物的作用機(jī)理及應(yīng)用

3 討論

異內(nèi)癥作為一種慢性炎癥性疾病，可引起嚴(yán)重的慢性疼痛(痛經(jīng)、性交困難、腹痛)和一系列生殖問題，長期困擾著世界各地數(shù)以百萬計的女性。盡管越來越多的證據(jù)表明遺傳、內(nèi)分泌、免疫、微生物和環(huán)境因素與異內(nèi)癥的發(fā)病相關(guān)[1]，但明確內(nèi)異癥的病因、發(fā)病機(jī)制和開發(fā)特異性治療藥物仍是難點。

本研究表明異位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜的基因表達(dá)譜整體相似，僅少部分基因差異表達(dá)，以下調(diào)基因為主。在異位內(nèi)膜病灶中受體配體活性、細(xì)胞因子活性和神經(jīng)遞質(zhì)受體活性的改變可能介導(dǎo)疾病的發(fā)生和疼痛的調(diào)節(jié)，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路和IL-17信號通路等通路的調(diào)控紊亂也與疾病發(fā)生密切相關(guān)，這與之前的研究相符[3]。深入分析病灶中的基因改變，F(xiàn)PR2、SAA1、RLN3、CXCL8、FPR1、PF4、CCR7和CXCL5共8個基因被認(rèn)為是關(guān)鍵的致病因素，是內(nèi)異癥潛在的生物標(biāo)志物。本研究首次顯示SAA1在人內(nèi)異癥病灶中的表達(dá)降低。已有研究表明SAA是由肝細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的一種急性期蛋白，參與維持黏膜組織中的免疫平衡，在肉牛子宮內(nèi)膜的正常和炎癥狀態(tài)中均表達(dá)[4]。炎癥消退后SAA1的高表達(dá)被認(rèn)為參與了子宮內(nèi)膜組織中免疫平衡的重建，因此，人內(nèi)異癥中低表達(dá)的SAA1可能反應(yīng)了組織中的炎癥狀態(tài)[4]。與Volpato et al[5]的研究一致，本研究顯示，在分泌晚期異位內(nèi)膜中FPR2和FPR1的表達(dá)水平均降低。膜粘連蛋白A1激活甲?；氖荏w2 /阿司匹林觸發(fā)脂蛋白(FPR2/ALX)可誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型分化，并減弱病灶中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)。阻斷FPR1和FPR2/ALX以及缺乏ANXA1都可導(dǎo)致腹腔血管平滑肌細(xì)胞中IL-6的生成增多，而IL-6水平與NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性呈負(fù)相關(guān)，其在降低內(nèi)異癥患者腹腔液中NK細(xì)胞的活性起至關(guān)重要的作用，有助于異位內(nèi)膜細(xì)胞的存活和植入[5]。已有報道[6-7]稱內(nèi)異癥患者的血清和腹腔液中CXCL8的表達(dá)均升高，CXCL8可通過促進(jìn)血管生成和內(nèi)膜細(xì)胞的附著、生長，在疾病發(fā)生中發(fā)揮作用。而該研究結(jié)果表明異位內(nèi)膜組織中CXCL8的表達(dá)水平相較正常內(nèi)膜下降?？紤]到包括CXCL8在內(nèi)的多種趨化因子配體可介導(dǎo)體內(nèi)多種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如IL-1β和TNF-α通過誘導(dǎo)p38 MAPK信號通路可介導(dǎo)CXCL8在異位內(nèi)膜中的表達(dá)[6]，因此，CXCL8在內(nèi)異癥中的價值仍需進(jìn)一步驗證。先前的研究[8]顯示宮腔粘連的子宮內(nèi)膜組織中CXCL5蛋白水平明顯降低，CXCL5的表達(dá)在維持正常內(nèi)膜的功能、抑制宮腔粘連形成中具有重要作用。因此，CXCL5在異位內(nèi)膜病灶中的下調(diào)表達(dá)可能與內(nèi)膜組織的損傷和粘連功能改變有關(guān)。CCR7被報道[9]在內(nèi)異癥中的表達(dá)升高，CCL19/CCR7軸可通過PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中B 細(xì)胞淋巴瘤因子2(BCL2)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲。該研究結(jié)果與之相反，提示可能有其他通路途徑參與調(diào)控CCR7在異位內(nèi)膜病灶中的表達(dá)。RLN3是一種肽激素，可通過G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化[10]。目前尚無關(guān)于內(nèi)異癥中RLN3和PF4的研究報道。

治療內(nèi)異癥，臨床常推薦的避孕藥、高效孕激素以及促性腺激素釋放激素激動劑 (GnRH-a)等多伴隨一系列副作用，因此開發(fā)特異性強(qiáng)的靶向藥物具有重要價值。篩得的硫代羅寧和氟硝利嗪被認(rèn)為是拮抗內(nèi)異癥的潛在藥物。硫代羅寧作用靶點包括甲狀腺激素受體α蛋白、β蛋白和增殖細(xì)胞核抗原蛋白。細(xì)胞增殖已被證實在內(nèi)異癥中起至關(guān)重要的作用，藏紅花素可通過靶向增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)抑制內(nèi)異癥的生長[11]。因此，硫代羅寧可能具有類似藏紅花素的功能——治療內(nèi)異癥。氟硝利嗪的作用靶點包括電壓依賴性T型鈣通道亞基α-1G、-1H、-1I蛋白和組胺H1受體蛋白以及鈣調(diào)蛋白。相比于正常內(nèi)膜，異位內(nèi)膜組織中鈣調(diào)蛋白表達(dá)增高，其可通過鈣調(diào)蛋白激活鈣調(diào)磷酸酶/活化T細(xì)胞核因子通路介導(dǎo)COX-2的表達(dá)，參與內(nèi)異癥中異位內(nèi)膜組織的增殖[12]。因此，作用于鈣調(diào)蛋白的靶向劑氟硝利嗪可能在治療內(nèi)異癥中具有潛在價值。

該研究使用生物信息學(xué)分析方法探究了內(nèi)異癥中多功能、多通路、多靶點的復(fù)雜致病因素，為進(jìn)一步篩選疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，闡明發(fā)病機(jī)制和開發(fā)靶向藥物提供了新思路。