邢紅宇，朱明月，李 偉，林 波

前列腺癌是多發(fā)生在40歲以上成人的一種惡性腫瘤，男性惡性腫瘤前列腺癌發(fā)病率明顯升高，在新發(fā)現(xiàn)的確診病例中大多為局部晚期或廣泛轉(zhuǎn)移患者，主要以手術治療為主，化療、放療等其它療法為輔，無法根治性治療，預后較差[1-2]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferases pi-1,GSTP1)具有保護細胞DNA堿基不受傷，抗腫瘤等功能。GSTP1表達沉默是正常前列腺上皮轉(zhuǎn)化為前列腺腺癌的標志[3]。槲皮素廣泛分布于植物中，具有多種生物作用，如抗氧化、清除自由基、抗感染、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。GSTP1基因啟動子區(qū)Cp G島甲基化是藥物治療前列腺癌的重要有效靶點。針對GSTP1的靶向治療，探討槲皮素對前列腺癌細胞(prostate cancer cells,LNCap)細胞GSTP1啟動子甲基化的影響與LNCap細胞增殖機制的關系，為腫瘤靶向治療提供臨床醫(yī)療機制支持。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器酶標儀(型號: DG3022A)購自南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司；細胞培養(yǎng)箱(型號: J-80B-III)購自上海杰涵實驗設備有限公司；蛋白印跡儀(型號: PROFIBLOT 48) 購自北京博宇騰輝科貿(mào)有限公司；流式細胞儀(貨號: BeamCyte，1026)購自常州必達科生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(貨號:D190411)購自上海鈺博生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(批號:D1937)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:D1932)、PCR檢測試劑盒(批號:D1946) 購自哈爾濱經(jīng)緯百科生物技術有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基(批號:507739)購自美國GIBCO公司；胎牛血清(批號:11019-8634) 購自杭州億楓生物公司; EZ DNA Methylation-Gold KitTM甲基化試劑盒(貨號: D5005)購自北京天漠科技開發(fā)有限公司；膜聯(lián)蛋白V(異硫氰酸熒光素碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate propidium iodide,FITC /PI) 細胞凋亡檢測試劑盒(貨號: T2190)購自上海恒斐生物科技有限公司；槲皮素(Solarbio，批號: IQ0010 -1) 購自上海恒斐生物科技有限公司；LNCaP細胞(編號: C0787) 購自上海冠導生物工程有限公司。鼠抗GSTP1購自南京碧云天生物科技有限公司；兔抗β-肌動蛋白(β-actin)和辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠二抗均購自美國 Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1分組及處理 體外培養(yǎng)LNCap細胞，分為空白組、低濃度組、中濃度組、高濃度組及對照組?？瞻?、低、中、高濃度組分別使用(0、10、40、80 μmol/L)槲皮素處理，對照組使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(5′- Aza-2′- deoxycytidine,5′-Aza-dC)(10 μmol/L)處理48 h。

1.2.2CCK-8檢測各組LNCap細胞增殖 從加入藥物處理開始，每隔12 h收集按實驗分組培養(yǎng)后的LNCap細胞消化離心，棄上清液，加MTT，孵育4 h，加入DMSO，按分組使用酶標儀檢測LNCap細胞懸液的吸光度(absorbance,OD490)值，計算各組LNCap細胞的抑制率=(1-實驗孔測定值)/對照孔測定值×100%，實驗3次，計算平均值。

1.2.3流式細胞術測定細胞凋亡率 收集按實驗分組培養(yǎng)后的LNCap細胞消化離心，調(diào)整濃度為1×106/ml的單細胞懸液，離心，孵育緩沖液洗滌，離心后用標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min后離心，孵育緩沖液洗滌，加入熒光溶液4 ℃下避光孵育20 min。取100 μl上流式細胞儀，流式細胞儀激發(fā)光波長用488 nm，波長515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，波長>560 nm的濾器檢測PI。檢測分析各組細胞凋亡情況。

1.2.4甲基化特異性PCR(MSP)檢測GSTP1啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài) 通過測序驗證：按試劑盒操作步驟，收集LNCap細胞，提取各組細胞的DNA，以重亞硫酸鹽處理，將非甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，甲基化的胞嘧啶(C)不變。設計合成GSTP1甲基化(M) 與非甲基化(U) 引物。MSP反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳。同時采用MethyLight定量PCR法定量分析GSTP1甲基化水平，并以甲基化百分比參數(shù)表示。

1.2.5Real-time PCR檢測GSTP1轉(zhuǎn)錄水平 收集各組LNCap 細胞，裂解細胞后，按TRIzol試劑盒操作步驟提取細胞總RNA，設計各基因引物序列，內(nèi)參基因β-actin，逆轉(zhuǎn)錄盒合成cDNA，檢測試劑盒檢測GSTP1 mRNA的基因表達，采用2-ΔΔCt法計算其相對表達量。

1.2.6Western blot檢測GSTP1蛋白水平 收集各分組LNCap細胞，裂解細胞后，取上清蛋白液，BCA盒測定分組細胞的蛋白含量。蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，結束后轉(zhuǎn)膜，加入GSTP1一抗，孵育過夜，清洗后加入二抗，進行孵育。設置內(nèi)參β-actin蛋白，分析GSTP1蛋白，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶積分吸光度值/β-actin蛋白條帶積分吸光度值。

2 結果

2.1 槲皮素對LNCap細胞增殖能力的影響低、中、高濃度組細胞增殖抑制率隨槲皮素濃度增加和時間的增長而升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。對照組細胞增殖抑制率在12、24、36、48 h時間均高于低、中濃度組，在36、48 h時間中均低于高濃度組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

2.2 槲皮素對LNCap細胞凋亡的影響低、中、高濃度組細胞凋亡率隨槲皮素濃度增加而升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，低、中濃度組細胞凋亡率降低，高濃度組升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2，圖1。

2.3 槲皮素對LNCap細胞中GSTP1啟動子區(qū)甲基化影響結果顯示，GSTP1基因在91 bp處出現(xiàn)甲基化條帶，93 bp處出現(xiàn)非甲基化條帶；在一定濃度范圍內(nèi)隨著槲皮素濃度增加，LNCap細胞中GSTP1啟動子區(qū)的甲基化程度減弱(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表3、圖2。

表1 各組LNCap細胞增殖能力的情況

圖1 流式細胞術檢測結果

表2 各組LNCap細胞凋亡的情況

圖2 各組LNCap細胞中GSTP1啟動子區(qū)甲基化水平

表3 各組LNCap細胞中GSTP1啟動子區(qū)甲基化水平

2.4 槲皮素對LNCap細胞中GSTP1表達的影響低、中、高濃度組GSTP1和GSTP1mRNA相對表達量隨槲皮素濃度增加而升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，低、中、高濃度組GSTP1蛋白相對表達量降低，低、中濃度組GSTP1mRNA相對表達量降低，高濃度組GSTP1mRNA相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，結果見表4、圖3。GSTP1甲基化水平與GSTP1和GSTP1mRNA表達水平呈負相關(r=-0.900、-0.836，均P<0.05)。

表4 各組LNCap細胞中GSTP1表達情況

圖3 各組LNCap細胞中GSTP1蛋白表達

3 討論

前列腺癌患者早期排尿困難，之后逐漸出現(xiàn)局部疼痛壓迫癥狀，并向周圍組織浸潤[5]。在前列腺癌相關成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)的DNA損傷修復基因沉默促進腫瘤進展[6]。GSTP1可主動保護細胞免受致癌物質(zhì)和親電子化合物的侵害。GSTP1的沉默會增加細胞中DNA損傷，人前列腺癌LNCaP細胞中GSTP1被抑制表達，基因沉默[7-8]。而GSTP1 DNA甲基化的基因沉默是前列腺癌發(fā)生和正常細胞發(fā)展為侵襲性癌的腫瘤進展的機制，可作為前列腺癌的診斷指標[9]。

對于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GSTs)修飾的控制，活化的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制是保護細胞免受氧化應激和癌癥發(fā)展傷害的重要機制[10-11]，筆者前期研究[12]研究表明，在人LNCaP細胞中減少GSTP1 CpG島的21個CpG位點的甲基化，誘導GSTP1的mRNA表達和蛋白表達可有效抑制癌細胞的發(fā)展。槲皮素是一種存在于水果、蔬菜等天然植物中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗感染、抗纖維化、抗腫瘤等作用[13]。眾多研究表明[14-15]利用槲皮素聯(lián)合化療藥物表現(xiàn)出抑制腫瘤生長和侵襲的作用，在腫瘤化學預防方面起著重要作用。

實驗結果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)隨著槲皮素用量增加，槲皮素可明顯抑制LNCap細胞生長增殖，減弱GSTP1啟動子區(qū)的甲基化程度；促進GSTP1mRNA和蛋白的表達，并對其有濃度依賴性。并且GSTP1 mRNA降低與GSTPl基因甲基化呈負相關。槲皮素可有效減弱LNCap啟動子甲基化程度，抑制LNCap細胞的生長增殖。

然而，由于槲皮素生物利用度低，水溶性低及在體內(nèi)被快速代謝和酶降解清除，嚴重阻礙了槲皮素在臨床上的使用，因此，需要對槲皮素進行結構修飾，改善其水溶性及抗腫瘤活性。