楊椋昕，鳳麟飛，李 芳，劉澤婷，王元銀

面神經(jīng)麻痹是部分或完全喪失面神經(jīng)功能，主要表現(xiàn)為面部表情肌群運(yùn)動(dòng)功能障礙，也稱為面癱[1]。當(dāng)面部肌群癱瘓時(shí)，出現(xiàn)一系列感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)障礙，如鼻唇溝消失，不能上提口角，眼瞼不能閉合，不能皺眉，額紋消失等。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然存在于食物中的多酚化合物，因其在控制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞死亡等多個(gè)靶點(diǎn)方面的益處而廣為人知[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是Res對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮有益作用的靶點(diǎn)之一[3]。Hermann et al[4]在兩項(xiàng)獨(dú)立研究中發(fā)現(xiàn)，Res提高了受損傷大腦中VEGF的表達(dá)水平，從而可能通過(guò)此緩解腦損傷。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建大鼠面神經(jīng)損傷模型研究Res對(duì)于面神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生的作用及VEGF在其作用機(jī)制中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物36只清潔級(jí)成年雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水，溫度為22～25 ℃，12 h/12 h交替照明。

1.2 動(dòng)物模型建立按隨機(jī)分組原則將大鼠分為2組，損傷組(Crush組)(n=24)和假手術(shù)組(Sham組)(n=8)。Crush組為該實(shí)驗(yàn)主要研究模型，按照0.35 ml/100 g對(duì)大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行全身麻醉；麻醉顯效后，無(wú)菌條件下對(duì)大鼠右側(cè)面部進(jìn)行解剖，切開皮膚，鈍性分離到達(dá)肌層，沿面神經(jīng)走向解剖，到達(dá)面神經(jīng)干部位分離面神經(jīng)，使用持針器夾持面神經(jīng)干90 s構(gòu)建面神經(jīng)損傷模型。Sham組同樣手術(shù)操作，但僅暴露面神經(jīng)干，不進(jìn)行損傷。兩組術(shù)后用3-0絲線常規(guī)進(jìn)行皮膚傷口的縫合。Crush組大鼠再隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組(Crush+Vehicle組)，損傷后僅使用對(duì)面神經(jīng)損傷后無(wú)任何作用的鹽水；②白藜蘆醇組(Crush+Res組)，此組在損傷后使用Res(Cat V90038，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；③抑制劑組(Crush+Res+Axitinib組)，損傷后使用Res和VEGF信號(hào)抑制劑Axitinib(Cat S1005，上海Selleck公司)。

1.3 藥物注射對(duì)Crush+Res組與Crush+Res+Axitinib組大鼠按照200 mg/kg腹腔注射Res，對(duì)照組注射生理鹽水。Crush+Res+Axitinib組大鼠額外在右側(cè)面部耳屏前使用微量注射器局部注射10 μmol/L的Axitinib 10 μl。所有藥物注射，每日1次，持續(xù)10 d。

1.4 QPCR檢測(cè)VEGFb及受體mRNA含量大鼠連續(xù)注射藥物10 d后，通過(guò)腹腔過(guò)量注射10%水合氯醛致死。麻醉致死后剪下大鼠頭部，迅速切開右側(cè)皮膚取出右側(cè)面神經(jīng)干，稱重后將其剪碎后按照每100 mg組織加入1 ml 的TRIzol試劑于勻漿器內(nèi)充分研磨。使用NanoDropND-3OOO檢測(cè)各面神經(jīng)組織樣本提取的mRNA濃度和純度，然后使用RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系制備cDNA進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性95 ℃、1 min，95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。各基因擴(kuò)增的引物序列見表1，各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

表1 基因引物序列

1.5 Western blot檢測(cè)VEGFb及受體蛋白含量大鼠連續(xù)注射藥物10 d后，致死后同QPCR的手術(shù)操作采集面神經(jīng)組織，稱重后在勻漿器中根據(jù)每100 mg加入1 ml RIPA裂解液(含1%PMSF)，充分研磨。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%BSA(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)在室溫下封閉1 h，將膜與稀釋抗體置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。使用的VEGFb抗體屬性為兔抗(1 ∶500, ab185696，英國(guó)Abcam公司)； VEGFR1抗體屬性為兔抗(1：500，ab2350，英國(guó)Abcam公司)；VEGFR2抗體屬性為兔抗(1 ∶400，26415-1-AP，美國(guó)proteintech公司)beta Actin抗體屬性為兔抗(1 ∶1 000，ab8227，英國(guó)Abcam公司)。按照1:5 000用二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(#7074, 美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，將膜置于二抗中在搖床上洗滌。參考相關(guān)說(shuō)明書，使用ECL發(fā)光試劑盒來(lái)檢測(cè)蛋白。設(shè)置適宜的曝光時(shí)間進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。使用ImageJ軟件對(duì)曝光后的蛋白條帶圖灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 免疫組化評(píng)估面神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生情況大鼠連續(xù)注射藥物10 d后，致死后同QPCR的手術(shù)操作采集面神經(jīng)組織，放入4%多聚甲醛(PA)溶液固定。隨后進(jìn)行梯度脫水，將組織放入1×PBS溶液配制的10%、20%的蔗糖溶液依次浸泡2 h，最后放入1×PBS溶液配制的30%蔗糖溶液在4 ℃下過(guò)夜。梯度脫水后包埋切片，含驢血清的PBST孵育1 h，使用兔抗NF200 (1 ∶100, 美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，在4 ℃下過(guò)夜。二抗標(biāo)記使用的是含特定驢血清抗體的Alex Fluor 488 (1 ∶400, 美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室)，置于室溫下2 h。最后滴加熒光淬滅封片液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，計(jì)算機(jī)獲取數(shù)據(jù)，成像。

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)側(cè)面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)情況通過(guò)免疫組化評(píng)估大鼠面神經(jīng)損傷后的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示，與Sham組相比，Crush+Vehicle組中NF200陽(yáng)性的軸突數(shù)目明顯減少，表明神經(jīng)纖維已被損傷，即模型的建立成功。與Crush+Vehicle組相比，Crush+Res組中NF200陽(yáng)性的軸突數(shù)目更多，說(shuō)明神經(jīng)纖維發(fā)生再生，即Res具有促進(jìn)面神經(jīng)損傷后的再生作用(圖1)。

圖1 3組大鼠面神經(jīng)損傷后免疫組化結(jié)果 ×20 A：Sham組；B：Crush+Vehicle組；C：Crush+Res組

圖2 各組大鼠中VEGFb、VEGFR1及VEGFR2的mRNA的表達(dá)水平

5.112、3.744、5.038)。以上的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明造模給藥10 d后，Res提高了面神經(jīng)中VEGFb、VEGFR1及VEGFR2蛋白的表達(dá)水平，而Axitinib也有效地抑制了Res提高VEGFb、VEGFR1及VEGFR2蛋白表達(dá)的作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.4 Axitinib對(duì)大鼠術(shù)區(qū)面神經(jīng)的神經(jīng)再生作用的影響通過(guò)免疫組化評(píng)估Axitinib在大鼠面神經(jīng)損傷后的作用，結(jié)果顯示，與Crush+Res組相比，Crush+Res+Axitinib組的NF200陽(yáng)性軸突數(shù)目明顯減少，說(shuō)明Res對(duì)神經(jīng)再生的促進(jìn)作用被Axitinib所抑制(圖4)。

3 討論

近些年來(lái)，Res在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用得到了廣泛的研究。Res具有多種作用于靶細(xì)胞、細(xì)胞生理學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)的藥理學(xué)作用。Res可能在不同的器官或細(xì)胞中對(duì)相同的靶點(diǎn)顯示出不同的效果。例如，Res已經(jīng)被證明可以降低內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的VEGF表達(dá)。Res通過(guò)激活神經(jīng)系統(tǒng)中的蛋白激酶B信號(hào)通路產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用[5]，也有學(xué)者[6]證實(shí)Res可通過(guò)提高機(jī)體內(nèi)蛋白激酶B磷酸化水平從而起到緩解腎臟損傷的作用。Res已被證明在治療各種類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用，包括中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血和脊髓損傷等。此外，Res在周圍神經(jīng)損傷動(dòng)物模型的治療中也顯示出了保護(hù)作用。例如Lindsey et al[7]發(fā)現(xiàn)Res通過(guò)長(zhǎng)期給藥顯示出對(duì)受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樹突的保護(hù)作用。

圖3 各組大鼠面神經(jīng)中VEGFb、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)水平

圖4 Crush+Res組和Crush+Res+Axitinib組面神經(jīng)的神經(jīng)再生情況 ×20A：Crush+Res組；B: Crush+Res+Axitinib組

VEGF是Res對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮有益作用的靶點(diǎn)之一[3]，近年來(lái)許多學(xué)者將VEGF作為神經(jīng)再生的有效中介進(jìn)行研究。VEGF可支持和促進(jìn)再生神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活[8-9]。Raimondo et al[9]證實(shí)VEGF和胰島素樣生長(zhǎng)因子1聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型中神經(jīng)支配功能的恢復(fù)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在神經(jīng)損傷后表現(xiàn)出更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。Ding et al[3]證實(shí)了使用Res 10 d后，與損傷組相比，Res組大鼠在一系列關(guān)于坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的檢測(cè)指標(biāo)上都體現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。Ding et al[3]通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)，Res應(yīng)用后促進(jìn)了損傷后軸突的恢復(fù)和再生。其中，作為Res靶點(diǎn)之一的VEGF信號(hào)通路被激活，其中VEGFb和VEGFR1及VEGFR2蛋白和mRNA表達(dá)均提高。以上的研究結(jié)果提示在大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型中，Res可能是通過(guò)激活機(jī)體內(nèi)的VEGF信號(hào)通路，提高了VEGFb mRNA與蛋白表達(dá)水平，最后達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)再生以及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用。但是Res在面神經(jīng)損傷模型中的作用及它是否影響VEGF相關(guān)的表達(dá)尚未得到研究。

本研究采用的是大鼠夾持損傷導(dǎo)致的面神經(jīng)損傷模型，在面神經(jīng)損傷后，使用Res可促進(jìn)VEGFb與其受體VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)，從而促進(jìn)了神經(jīng)再生的發(fā)生，且Res對(duì)于神經(jīng)再生的有效作用可被VEGF抑制劑Axitinib所抑制。Res對(duì)于面神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生具有促進(jìn)作用，且可能是通過(guò)激活機(jī)體內(nèi)的VEGF信號(hào)通路使VEGFb和其受體VEGFR1和VEGFR2的mRNA和蛋白表達(dá)增加來(lái)實(shí)現(xiàn)這一作用。

本實(shí)驗(yàn)參考Ding et al[3]的文章，后續(xù)希望能夠通過(guò)對(duì)Res使用劑量和時(shí)間的研究來(lái)完善補(bǔ)充Res和面神經(jīng)神經(jīng)再生之間的量效關(guān)系以及增加對(duì)照藥物的實(shí)驗(yàn)來(lái)提高可信度及準(zhǔn)確度。