謝亞鋒，許志杰，丁雅婷，閆圣玉，張 僑，劉菀瑩，劉麗兵

結(jié)腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，在全球癌癥相關(guān)死亡率中排行第三[1]。由于結(jié)腸癌具有局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及化療耐藥的特性，是一種高死亡率的疾病[2]。尋找更多的潛在治療性生物靶標(biāo)是治療結(jié)腸癌的理想思路。AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是能量代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子，參與調(diào)控介導(dǎo)自噬的過程[3]。自噬通過消化功能失調(diào)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，在致癌作用中起重要作用[4]?？咕腖L-37是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種組織蛋白酶類抗菌肽，由前體肽hCAP-18水解釋放[5]。研究[6-9]表明，LL-37在胃癌、肺癌、黑色素瘤及白血病中異常表達(dá)。作為腫瘤抑制因子，hCAP18/LL-37在胃腺癌和淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)下調(diào)。然而，AMPK和自噬是否參與了抗菌肽LL-37對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控尚不明確。該研究探討了抗菌肽LL-37對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為明確相關(guān)作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購自北京北納生物(BNCC)細(xì)胞庫。McCOY's 5A培養(yǎng)基購自美國SIGMA公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；AMPK抑制劑購自德國Merck公司；抗菌肽LL-37購自上海銳東生物科技有限公司；Annexin-V FITC/PI雙染試劑盒購自上海貝博生物公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；兔抗Bax(1 ∶1 000)、兔抗Bcl-2(1 ∶2 000)、兔抗p-AMPK(1 ∶1 000)、兔抗LC3A(1 ∶50 000)、兔抗LC3B(1 ∶1 000)、兔抗GAPDH(1 ∶2 500)、兔抗AMPK(1 ∶1 000)、兔抗Beclin1(1 ∶2 000)、兔抗Atg5(1 ∶1 000)、二抗山羊抗兔IgG(1 ∶2 000)均購自英國ABCAM公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)購自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司； CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購自德國萊卡公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司；電泳儀和全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理使用含有10%FBS的McCOY’s 5A 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。將細(xì)胞分為對照組、低濃度組(50 μg/ml)、中濃度組(100 μg/ml)和高濃度組(200 μg/ml)，檢測不同濃度抗菌肽LL-37處理48 h對HT-29細(xì)胞凋亡，AMPK活性以及自噬的影響。此外，將細(xì)胞分為高濃度組(200 μg/ml)和高濃度LL-37聯(lián)合 AMPK抑制劑組，先采用AMPK抑制劑(10 μmol/L)預(yù)處理30 min后，再采用高濃度200 μg/ml抗菌肽LL-37處理48 h，檢測AMPK被抑制后，抗菌肽LL-37對HT-29細(xì)胞凋亡和自噬的作用。

1.4 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測HT-29細(xì)胞凋亡取對數(shù)期細(xì)胞，以2×105個(gè)/ml細(xì)胞濃度接種于6孔板中，分組處理后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105個(gè)/ml，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，用500 μl PBS溶液將細(xì)胞重懸。每孔分別加入5 μl Annexin-FITC和5 μl PI，充分混勻后室溫避光30 min。完成孵育后立刻上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡定量檢測。

1.5 Western blot檢測HT-29細(xì)胞凋亡、AMPK以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)分組處理48 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液后，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度后，用10 %的SDS-PAGE膠分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。用5 %脫脂奶粉封閉后，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜。再將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后，加入ECL顯色，曝光后采集圖片。以GADPH為內(nèi)參，用軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽LL-37促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡Annexin-V FITC/PI雙染法檢測結(jié)果(圖1)顯示，4組細(xì)胞進(jìn)行比較，組間凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=195.01，P<0.001)。與對照組比較，低濃度組細(xì)胞凋亡率沒有改變，而中濃度和高濃度細(xì)胞凋亡率升高(t=12.79,P<0.001；t=22.14，P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果(圖2)顯示，4組細(xì)胞進(jìn)行比較，凋亡率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.53，P<0.001)；與對照組比較，低濃度組Bcl-2/ Bax沒有變化，而中濃度和高濃度細(xì)胞Bcl-2/Bax降低(t=9.87，P<0.05；t=12.93，P<0.01)。結(jié)果表明一定濃度的抗菌肽LL-37能促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡。

2.2 抗菌肽LL-37促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞自噬Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示，4組細(xì)胞進(jìn)行比較，LC3II/LC3I(F=91.08，P<0.001)、Atg5(F=54.11，P<0.001)以及Beclin1(F=47.28，P<0.001)表達(dá)水平組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比較，低濃度組細(xì)胞Beclin1、Atg5以及LC3II/LC3I沒有變化，而中濃度和高濃度組細(xì)胞Beclin1(t=7.75，P<0.05；t=8.63，P<0.01)、Atg5(t=6.189，P<0.01；t=13.12，P<0.001)以及LC3II/LC3I提高(t=12.94，P<0.001；t=13.13，P<0.001)。結(jié)果說明一定濃度的抗菌肽LL-37能促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測HT-29細(xì)胞凋亡

圖2 Western blot法檢測凋亡蛋白表達(dá)水平

圖3 抗菌肽LL-37在HT-29細(xì)胞中對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 抗菌肽LL-37促進(jìn)AMPK信號(hào)異常激活Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)顯示，4組細(xì)胞進(jìn)行比較，p-AMPK/AMPK(F=112.70，P<0.001)表達(dá)水平組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比較，低濃度組細(xì)胞p-AMPK/AMPK無變化，而中濃度和高濃度組細(xì)胞p-AMPK/AMPK升高(t=6.76，P<0.01；t=15.76，P<0.01)。結(jié)果表明一定濃度的抗菌肽LL-37能激活A(yù)MPK信號(hào)。

圖4 抗菌肽LL-37在HT-29細(xì)胞中對AMPK活化的影響

2.4 阻斷AMPK信號(hào)抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡Annexin-V FITC/PI雙染法檢測結(jié)果(圖5)顯示，與高濃度組比較，高濃度+AMPK抑制劑組細(xì)胞凋亡率降低(t=7.70，P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果(圖6)顯示，與高濃度組比較，高濃度+AMPK抑制劑組Bcl-2/ Bax升高(t=7.74，P<0.05)。結(jié)果表明AMPK信號(hào)參與了抗菌肽LL-37促結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的作用。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

圖6 Western blot法檢測凋亡蛋白表達(dá)水平

2.5 阻斷AMPK信號(hào)抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞自噬Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖7)顯示，與高濃度組比較，高濃度+AMPK抑制組細(xì)胞Beclin1(t=12.28，P<0.01)、Atg5(t=7.00，P<0.01)以及LC3II/LC3I降低(t=6.03，P<0.01)。結(jié)果提示AMPK參與了抗菌肽LL-37促結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞發(fā)生自噬的作用。

圖7 阻斷AMPK信號(hào)對抗菌肽LL-37處理的HT-29細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一類具有抗菌活性的先天免疫效應(yīng)分子活性肽，主要由上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞合成和釋放。當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)外源刺激時(shí)，前體肽原h(huán)CAP-18便會(huì)水解釋放LL-37。由于N端前兩個(gè)氨基酸殘基為亮氨酸(L)，而總氨基酸殘基總數(shù)為37，因此命名為LL-37[10]。有研究[11]提出，抗菌肽LL-37作為腫瘤抑制因子，在結(jié)腸癌中LL-37的表達(dá)下調(diào)，并且臨床樣本檢測顯示，LL-37與腫瘤細(xì)胞的凋亡緊密相關(guān)。結(jié)合LL-37在結(jié)腸癌中的表達(dá)下調(diào)和LL-37與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)，可以猜想LL-37在結(jié)腸癌發(fā)生中是否具有促/抗凋亡功能。有數(shù)據(jù)[12]顯示，在p53野生型結(jié)腸癌細(xì)胞中，LL-37誘導(dǎo)磷脂酰絲氨酸外顯和DNA片段化而不激活半胱天冬酶，說明LL-37能誘導(dǎo)半胱天冬酶依賴性凋亡的發(fā)生。小鼠源性抗菌肽(mouse cathelin-related antimicrobial peptide，mCRAMP)灌腸研究[13]發(fā)現(xiàn)降低了氧化氮甲烷和硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌癌小鼠的腫瘤大小和數(shù)量，但不誘導(dǎo)腫瘤和相鄰正常結(jié)腸組織的細(xì)胞凋亡。本研究顯示，抗菌肽LL-37能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡，異常激活HT-29細(xì)胞自噬，并且LL-37對結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的作用呈濃度梯度趨勢。

AMPK作為一種中樞代謝調(diào)節(jié)因子，是一種維持細(xì)胞能量平衡的代謝應(yīng)激傳感酶，已被廣泛應(yīng)用于能量消耗或補(bǔ)償途徑。葡萄糖/糖原代謝是一種主要的代謝途徑，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，如增殖、生長和抗應(yīng)激。葡萄糖饑餓是一種有效的生理性AMPK激活狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，AMPK會(huì)根據(jù)細(xì)胞或組織觸發(fā)各種代謝事件。自噬是一種重要的降解途徑，它不僅能維持細(xì)胞內(nèi)平衡，去除蛋白質(zhì)聚集物和功能失調(diào)的亞細(xì)胞器等潛在的危險(xiǎn)成分，而且還能對營養(yǎng)缺乏等代謝應(yīng)激作出適應(yīng)性反應(yīng)。證據(jù)[14]表明，自噬與包括AMPK在內(nèi)的營養(yǎng)信號(hào)模塊密切相關(guān)，以根據(jù)許多不同的細(xì)胞信號(hào)對代謝途徑進(jìn)行微調(diào)，AMPK和自噬對代謝紊亂也有一定的作用。本研究顯示，抑制AMPK活性，能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡和自噬發(fā)生。有研究[15]提出，抗菌肽LL-37參與了4-苯基丁酸鹽(PBA)對人巨噬細(xì)胞結(jié)核分歧桿菌(MTB)的自噬誘導(dǎo)，并且呈依賴性。沉默LL-37，PBA不能誘導(dǎo)MTB感染的人巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬，當(dāng)重新補(bǔ)充LL-37后，PBA恢復(fù)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬功能[15]。本研究顯示，抗菌肽LL-37能異常激活A(yù)MPK的活性，且呈濃度趨勢。在抗菌肽LL-37處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中添加AMPK抑制劑后，抑制AMPK能抑制LL-37處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡，降低LL-37處理后的HT-29細(xì)胞的自噬。

綜上所述，抗菌肽LL-37能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡，并且該過程與激活A(yù)MPK介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬相關(guān)。該結(jié)果為深入了解抗菌肽LL-37促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制提供了一部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)的潛在靶向治療提供了思路。