王曉萌，李真真*，孟 蓮，張?？?，黨鴻蔚，李 鋒，劉春霞

橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma, RMS)好發(fā)于兒童及青少年[1]，常見(jiàn)亞型為胚胎性橫紋肌肉瘤(embryonal RMS，ERMS)、腺泡型橫紋肌肉瘤(alveolar RMS，ARMS)，ERMS發(fā)病率約60%，ARMS發(fā)病率約20%；由于ARMS中存在PAX3/PAX7-FOXO1融合基因，其惡性程度高，致死率更高[2]。已在成肌細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)PAX3-FOXO1的表達(dá)可以促進(jìn)RMS的發(fā)展[3]。因此，全面探索融合基因在RMS細(xì)胞中發(fā)揮的作用就顯得尤為重要。

miRNA作為一種非編碼RNA，對(duì)癌癥的抑制或表達(dá)發(fā)揮重要作用。miR-27a等不同miRNA可以促進(jìn)RMS侵襲、遷移等生物學(xué)行為[4]，但尚未見(jiàn)在RMS細(xì)胞中比較融合基因陽(yáng)性和陰性的生物學(xué)行為的研究，融合基因和miRNA的相關(guān)研究較少。因此，該文將比較RMS細(xì)胞融合基因陽(yáng)性和陰性的生物學(xué)行為并結(jié)合生物信息學(xué)分析差異miRNA，為后續(xù)基因及信號(hào)通路的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)人RD和PLA-802細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)； RH30細(xì)胞系購(gòu)自上海復(fù)翔生物技術(shù)有限公司；PLA-802、RH30和RD細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)賽默飛公司)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑Cell Counting Kit-8購(gòu)自上海東仁化學(xué)技術(shù)有限公司；Total RNA Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；Ultra SYBR Mixture(Low ROX)購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；TIAN Script RT Kit購(gòu)自北京天根生物科技公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning Coster公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司；miRNA引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1CCK-8試驗(yàn) 在96孔板中(3×103個(gè)/孔)接種RMS細(xì)胞，分別在0、24、48和72 h，向RMS細(xì)胞中加入CCK-8試劑(10 μl/孔)，并在37 ℃、5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中孵育2 h。避光使用Biotek酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)記錄450 nm的吸光度(optical density, OD)值。

1.3.2Transwell試驗(yàn) 收集RMS細(xì)胞(200 μl，25 000個(gè)/孔)。侵襲試驗(yàn)需提前2 h在小室內(nèi)加入基質(zhì)膠，隨后更換DMEM培養(yǎng)基水化30 min，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸RMS細(xì)胞后置于小室內(nèi)，將小室置于20%FBS的600 μl DMEM培養(yǎng)基的24孔板中孵育2 d，小室用4%多聚甲醛固定20 min后晾干，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min后用棉球輕輕擦拭上層，在顯微鏡下拍照記錄。遷移試驗(yàn)則無(wú)需鋪基質(zhì)膠，在37 ℃下孵育24 h后，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同遷移試驗(yàn)。利用Image J軟件計(jì)數(shù)和SPSS統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù) 將細(xì)胞鋪到6孔板(1×104個(gè)/孔)中，2 d后，消化收集RMS細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，以1×106個(gè)/ml的濃度重懸于500 μl Binding Buffer中。向RMS細(xì)胞懸液中加入Annexin VAPC/PI雙染試劑各5 μl。雙染后1 h之內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分比，并記錄凋亡率。

1.3.4差異miRNA分析 利用GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE97553數(shù)據(jù)集，包含患者的PAX3-FOXO1融合基因陰性細(xì)胞(3株：RD、RH2、RH18)和PAX3-FOXO1融合基因陽(yáng)性細(xì)胞(5株：RH3、RH4、RH30、RH28、RH41)的miRNA芯片表達(dá)譜，運(yùn)用在線軟件GEO2R分析融合基因陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的差異miRNA， SangerBox分析差異miRNA繪制火山圖， |log2FC| >3，P<0.05，設(shè)定篩選差異miRNA為有意義的閾值。

1.3.5qRT-PCR檢測(cè)篩選miRNA RMS細(xì)胞鋪到12孔板培養(yǎng)2 d后消化離心，棄上清液，加入700 μl QIAzol 裂解試劑混勻靜置5 min，加入140 μl三氯甲烷混勻，室溫靜置15 min后離心，吸上清液加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇混勻后，吸700 μl液體加入柱子上離心10 000 r/min，15 s，4 ℃。利用Total RNA Kit試劑盒提取總RNA，將提取miRNA測(cè)濃度后，試劑盒miScript II RT Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，聯(lián)合SYBR Green PCR Kit試劑盒上樣后利用7500實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 融合基因陽(yáng)性RH30細(xì)胞的遷移、侵襲能力最強(qiáng)RMS細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計(jì)RH30細(xì)胞、RD細(xì)胞和PLA-802細(xì)胞的穿孔數(shù)量，結(jié)果顯示RH30細(xì)胞的遷移能力高于RD細(xì)胞和PLA-802細(xì)胞(F=226.514，P均=0.000)。RMS細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計(jì)RH30細(xì)胞和RD細(xì)胞、PLA-802細(xì)胞的穿孔數(shù)量，結(jié)果顯示RH30細(xì)胞的侵襲能力高于RD細(xì)胞和PLA-802細(xì)胞(F= 90.917,P均=0.000)。 見(jiàn)圖1。

2.2 融合基因陰性RD細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)分析3株RMS細(xì)胞在0、24、48和72 h的OD值，并繪制OD曲線。0 h時(shí)RD、RH30和PLA-802細(xì)胞的OD值曲線結(jié)果顯示各組之間無(wú)差異(F=0.293，P>0.05)。在24、48、72 h時(shí)，RD細(xì)胞的增殖能力高于RH30和PLA-802細(xì)胞的增殖能力(F=29.16，PRH30=0.004，PPLA-802=0.000；F=109.726，PRH30=0.000，PPLA-802=0.000；F=56.646，PRH30=0.001，PPLA-802=0.000)(P<0.05)。此外，RH30細(xì)胞的增殖能力高于PLA-802細(xì)胞的增殖能力。所有結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 3株RMS細(xì)胞系的遷移和侵襲能力

圖2 3株細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力

2.3 融合基因陽(yáng)性RH30細(xì)胞的抗凋亡能力最強(qiáng)在RMS細(xì)胞中加入Annexin V-APC / PI試劑后檢測(cè)其凋亡能力，結(jié)果顯示RH30細(xì)胞的凋亡率低于RD細(xì)胞和PLA-802細(xì)胞(F=7.415，PRD=0.015，PPLA-802=0.016)。PLA-802細(xì)胞與RD細(xì)胞之間的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.040，P=0.97)。3株RMS細(xì)胞中，RH30的抗凋亡能力高于RD和PLA-802。見(jiàn)圖3。

2.4 篩選差異miRNAGEO2R分析RMS中融合基因陽(yáng)性細(xì)胞和融合基因陰性細(xì)胞中差異miRNA，利用sangerbox中火山圖分析差異miRNA，紅色代表上調(diào)miRNA，綠色代表下調(diào)miRNA(圖4)。根據(jù)|log2FC|>3，P<0.05，篩選得到12個(gè)差異miRNA，其中上調(diào)miRNA有3個(gè)，分別為miR-1、let-7d-5p和let-7b-5p，下調(diào)miRNA有9個(gè)，分別為miR-196a-5p、miR-455-3p、miR-21-5p、miR-193a-3p、miR-29b-3p、miR-29a-3p、miR-100-5p、miR-222-3p和miR-221-3p(表1)。

表1 篩選差異miRNA

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證差異miRNA在RH30細(xì)胞、PLA-802細(xì)胞、RD細(xì)胞中利用qRT-PCR檢測(cè)篩選出的12個(gè)差異miRNA，結(jié)果顯示miR-1(F=28.908，PRD=0.001，PPLA-802=0.000)，let-7d-5p(F=187.469，PRD=0.000，PPLA-802=0.000)和let-7b-5p(F=2920.115，PRD=0.000，PPLA-802=0.000)在融合基因陽(yáng)性RH30細(xì)胞中表達(dá)高于融合基因陰性PLA-802細(xì)胞和RD細(xì)胞(圖5)；miR-196a-5p(F=98.196，PRD=0.000，PPLA-802=0.001)，miR-455-3p(F=8.773，PRD=0.006，PPLA-802=0.040)，miR-21-5p(F=187.469，PRD=0.000，PPLA-802=0.000)，miR-193a-3p(F=87.856，PRD=0.000，PPLA-802=0.002)，miR-29b-3p (F=16.142，PRD=0.001，PPLA-802=0.044)，miR-29a-3p(F=16.573，PRD=0.006，PPLA-802=0.002)，miR-100-5p(F=13.040，PRD=0.002，PPLA-802=0.038)，miR-222-3p(F=53.234，

圖3 3株細(xì)胞系的抗凋亡能力

圖4 火山圖分析差異miRNA

PRD=0.000，PPLA-802=0.003)和miR-221-3p(F=48.550，PRD=0.000，PPLA-802=0.003)在融合基因陰性RD細(xì)胞和PLA-802細(xì)胞中表達(dá)高于融合基因陽(yáng)性RH30細(xì)胞(圖5)。上述結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。

圖5 qRT-PCR分析篩選差異miRNA的mRNA表達(dá)

3 討論

ARMS中75%～80%存在t(2;13)(q36;q14)/PAX3-FOXO1或t(1; 13)(p36; q14)/PAX7-FOXO1易位，對(duì)RMS的發(fā)生發(fā)展起重要作用[5]。Williamson et al[6]在210位RMS患者中運(yùn)用Kaplan-Meier分析無(wú)病生存率和總體生存率，結(jié)果顯示融合基因陽(yáng)性RMS患者的轉(zhuǎn)移比例高于融合基因陰性的RMS患者，融合基因陽(yáng)性患者比融合基因陰性患者預(yù)后差。本文在RMS細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)，融合基因陽(yáng)性RH30細(xì)胞的侵襲、遷移和抗凋亡能力高于融合基因陰性PLA-802細(xì)胞和RD細(xì)胞，而CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示RD 的增殖能力高于RH30和PLA-802，融合基因可能對(duì)RMS細(xì)胞的侵襲、遷移及抗凋亡能力起主要作用，對(duì)RMS細(xì)胞的增殖能力影響較小，可做進(jìn)一步研究，為RMS的分子信號(hào)通路研究提供參考。

miRNA不僅參與正常的細(xì)胞生物進(jìn)程，在腫瘤中同樣發(fā)揮重要的作用。在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA-144抑制CEP55的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[7]。在RMS中，融合基因不僅影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，對(duì)miRNA同樣發(fā)揮重要作用，過(guò)表達(dá)PAX3-FOXO1激活促進(jìn)miR-486-5p的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ARMS的發(fā)展[8]。

本研究利用生物信息學(xué)分析miRNA芯片表達(dá)譜篩選RMS融合基因陽(yáng)性和陰性的差異miRNA并利用qRT-PCR證實(shí)miR-196a-5p、miR-455-3p、miR-193a-3p、miR-100-5p、miR-222-3p和miR-221-3p等在RMS融合基因陽(yáng)性中的表達(dá)低于融合基因陰性的RMS，在RMS融合基因陽(yáng)性中可能發(fā)揮抑制作用。

Zhan et al[9]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中miR-455-3p表達(dá)降低，PDZ結(jié)合基序(TAZ)為Hippo途徑的關(guān)鍵因子，過(guò)表達(dá)miR-455-3p靶向抑制TAZ表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。Mohamed et al[10]研究表明在RMS中TAZ促進(jìn)RD(ERMS)細(xì)胞的增殖及成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Lu et al[11]發(fā)現(xiàn)在耐西妥昔單抗的大腸癌中miR-100過(guò)表達(dá)，lncRNA MIR100HG可以驅(qū)動(dòng)miR-100和miR-125b協(xié)調(diào)抑制Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，增強(qiáng)Wnt信號(hào)表達(dá)導(dǎo)致耐藥，不利于腫瘤的治療。Singh et al[12]在p53和c-fos雙突變表達(dá)降低的小鼠模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，與正常成肌細(xì)胞相比，ERMS中的Wnt信號(hào)通路被下調(diào)。Xu et al[13]研究表明miR-196a-5p是唯一連接LOC134466和TAC1的miRNA，過(guò)表達(dá)LOC134466可抑制miR-196a-5p，促進(jìn)TAC1的表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。Wang et al[14]在肝癌中利用生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-221-3p/miR-222-3p高表達(dá)，其預(yù)測(cè)靶基因CBFB、UBE2N在肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)表現(xiàn)良好，可能是肝癌預(yù)后的指標(biāo)。本研究miR-221-3p/miR-222-3p等miRNA在RMS融合基因陰性的表達(dá)高于融合基因陽(yáng)性，上述研究為RMS中研究差異miRNA提供參考，可利用miRNA做進(jìn)一步研究。

綜上，融合基因陽(yáng)性的RMS細(xì)胞侵襲、遷移和抗凋亡能力高于融合基因陰性RMS細(xì)胞，融合基因?qū)Σ町恗iRNA的表達(dá)可能起重要作用，這為深入研究融合基因在RMS的分子作用機(jī)制及靶向藥物的研究奠定基礎(chǔ)。