林 霄，孫國平，章 菊,2，劉加濤

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，晚期肝癌病死率位列第三，5年生存率僅為14%[1]。內(nèi)科治療是肝癌患者的主要選擇，但治療效果并不理想。近年來中藥天然產(chǎn)物因其溫和的副作用和優(yōu)良的治療效果受到許多關(guān)注[2]，研究[3-4]表明槐耳清膏在乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中均能起到有效的抗腫瘤作用。此外，無論是單獨(dú)使用還是聯(lián)合用藥，槐耳清膏都表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性[5]。許多藥物在治療腫瘤的同時(shí)能夠引發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，而ERS是導(dǎo)致惡性腫瘤耐藥的主要原因[6]，但槐耳清膏能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生ERS尚不明確。該文首先探討槐耳清膏在治療肝癌的同時(shí)能否引發(fā)肝癌細(xì)胞ERS，再與ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)聯(lián)合使用，探究抑制ERS能否增強(qiáng)槐耳清膏的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源肝癌細(xì)胞株Hep3B和HepG2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞系經(jīng)STR鑒定，用qPCR分析細(xì)胞內(nèi)無支原體。以高糖DMEM(美國Hyclone公司)加入10%胎牛血清(澳大利亞Clark公司)和青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/ml)配置成細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2加濕的培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑槐耳清膏(啟東蓋天利醫(yī)藥有限公司)用DMEM充分溶解，稀釋成10 mg/ml，用0.22 μm濾膜過濾2次，保存在-80 ℃冰箱中。MTT檢測試劑盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物科技公司)，4-PBA(P21005，美國Sigma公司)，PMSF蛋白酶抑制劑、RIPA細(xì)胞裂解緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)公司)，Bax(ab32503)、CHOP(ab11119)和GRP78(ab21685)一抗(英國Abcam公司)，PERK(BS2156)和Bcl-2(BS3171)一抗(美國Bioworld Technology Inc公司)，IRE1(#3294)一抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3 MTT法測定細(xì)胞活力肝癌細(xì)胞(5 000個(gè)/孔)接種在96孔板中培養(yǎng)過夜，與不同濃度(0、2、4、6、8 mg/ml)的槐耳清膏共同孵育。培養(yǎng)24 h后，每孔中加入20 μl MTT，孵育4 h，然后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解甲醛晶體，水平搖床低速震蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度(optical density,OD)值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：抑制率(%)=(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對照組OD值×100%，槐耳清膏濃度為橫坐標(biāo)，肝癌細(xì)胞活性為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線圖，并計(jì)算槐耳清膏對2種肝癌細(xì)胞的IC50值。

1.4 Western blot將一組細(xì)胞單獨(dú)使用槐耳清膏進(jìn)行處理，另一組使用槐耳清膏與4-PBA聯(lián)合用藥，2組均處理24 h后消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，再用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液在冰上裂解細(xì)胞30 min。將裂解液離心，收集上清液。加4×loading buffer，沸水煮10 min。用SDS-PAGE凝膠提取蛋白，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。再用5%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)在室溫封閉1 h，4 ℃水平搖床與特異性一抗(1 ∶1 000)孵育過夜。隔日在室溫下用二抗(1 ∶4 000)孵育1 h，用Image QuantTmlAS-4000Mini Imager檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并用Scion圖像軟件(4.0.3.2版)進(jìn)行量化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析將一組細(xì)胞單獨(dú)使用槐耳清膏進(jìn)行處理，另一組使用槐耳清膏與4-PBA聯(lián)合用藥。處理24 h后用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)對細(xì)胞進(jìn)行消化。用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒按照說明檢測細(xì)胞凋亡情況。用400 μl的Annexin V binding buffer重懸細(xì)胞，每管加入5 μl Annexin-V-FITC染色15 min，然后加入10 μl PI孵育5 min，上機(jī)檢測。所有過程均避光操作。

2 結(jié)果

2.1 槐耳清膏濃度與肝癌細(xì)胞活力的關(guān)系為測定槐耳清膏對肝癌細(xì)胞活力的影響，采用不同劑量的槐耳清膏(0、2、4、6、8 mg/ml)與肝癌細(xì)胞株Hep3B和HepG2共培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測細(xì)胞活力變化。與對照組相比，槐耳清膏能夠抑制肝癌細(xì)胞活力(P<0.05)，Hep3B和HepG2細(xì)胞活力與槐耳清膏濃度呈劑量依賴性下降(圖1)。

圖1 MTT法測定肝癌細(xì)胞活力

2.2 槐耳清膏介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的能力為了探討槐耳清膏對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，用AnnexinV-FITC/PI試劑盒進(jìn)行了流式分析。結(jié)果顯示槐耳清膏濃度為0、4、8 mg/ml時(shí)Hep3B細(xì)胞及HepG2細(xì)胞凋亡率明顯升高，表明肝癌細(xì)胞凋亡率與槐耳清膏濃度呈正相關(guān)(圖2A、B、C)。為了探究槐耳清膏誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，使用Western blot檢測細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)變化。如圖2D、E、F所示，槐耳清膏可以下調(diào)肝癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)而上調(diào)Bax的表達(dá)，與對照組相比，Bcl-2/Bax下降(P<0.05)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

2.3 槐耳清膏誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生ERS的能力槐耳清膏處理后的肝癌細(xì)胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK和IRE1的表達(dá)與對照組相比明顯上調(diào)(P<0.05)(圖3)。結(jié)果表明槐耳清膏可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株Hep3B和HepG2產(chǎn)生ERS。

2.4 4-PBA抑制槐耳清膏誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞ERS用4-PBA(500 μmol/L)處理細(xì)胞12 h，將細(xì)胞與槐耳清膏(8 mg/ml)共培養(yǎng)24 h，通過Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明槐耳清膏聯(lián)合4-PBA與單獨(dú)使用槐耳清膏相比，肝癌細(xì)胞中IRE1和PERK的表達(dá)減少(P<0.05)(圖4)，4-PBA可抑制槐耳清膏誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞ERS。

2.5 抑制肝癌細(xì)胞ERS對槐耳清膏的抗腫瘤作用的影響為了驗(yàn)證槐耳清膏誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞ERS是否會影響肝癌細(xì)胞凋亡，用4-PBA(500 μmol/L)處理肝癌細(xì)胞12 h，再將細(xì)胞與槐耳清膏(8 mg/ml)共培養(yǎng)24 h，用AnnexinV-FITC/PI試劑盒和Western blot進(jìn)行檢測。4-PBA聯(lián)合槐耳清膏組與單獨(dú)使用槐耳清膏相比肝癌細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05)(圖5A、B、C)。再用MTT法檢測肝癌細(xì)胞活力，結(jié)果為4-PBA聯(lián)合槐耳清膏與單獨(dú)使用槐耳清膏相比肝癌細(xì)胞的活力明顯下降(P<0.05)(圖5D)。說明槐耳清膏誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞ERS能夠抑制細(xì)胞凋亡，而聯(lián)合4-PBA能抑制細(xì)胞ERS的發(fā)生，使肝癌細(xì)胞活力下降、凋亡率上升。

用Western blot檢測了肝癌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與單獨(dú)使用槐耳清膏相比，4-PBA聯(lián)合槐耳清膏能更有效地降低肝癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平而上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，使Bcl-2/Bax下降(P<0.05)(圖5E、F、G)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

3 討論

低氧、營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激和許多其他刺激都能導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)中聚集，從而誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生ERS。為了提高蛋白質(zhì)的折疊能力，ER將啟動一系列的適應(yīng)過程，此過程被稱為未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)[7]。許多研究[8]表明ERS不僅能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，還與癌癥的其他進(jìn)程密切相關(guān)[8]。本研究中，產(chǎn)生ERS的肝癌細(xì)胞與ERS被抑制的肝癌細(xì)胞相比，細(xì)胞活力更強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少。

越來越多的研究表明，抗癌藥物在殺傷腫瘤的同時(shí)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ERS。如紫杉醇、阿霉素和西妥昔單抗[9]均能有效地誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，激活UPR。持續(xù)的UPR信號能夠促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和對化療耐藥[4]。然而在一些腫瘤中，持續(xù)和嚴(yán)重的ERS可以導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡[10]，例如硼替佐米能夠誘導(dǎo)慢性ERS并使塞來昔布?xì)⑺乐旅舻哪z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[11]。但關(guān)于槐耳清膏能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞ERS的研究很少。本研究顯示經(jīng)槐耳清膏處理后的肝癌細(xì)胞中ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK和IRE1的表達(dá)增加，說明槐耳清膏可以誘發(fā)肝癌細(xì)胞ERS。

圖2 槐耳清膏誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

圖3 槐耳清膏誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生ERS

圖4 4-PBA抑制槐耳清膏誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞ERS

圖5 抑制肝癌細(xì)胞ERS可增強(qiáng)槐耳清膏的抗腫瘤能力

A、B：Hep3B、HepG2細(xì)胞凋亡情況；C：Hep3B、HepG2細(xì)胞凋亡差異；D：Hep3B、HepG2細(xì)胞活力的差異；E、F：Western blot法檢測Hep3B、HepG2B細(xì)胞Bcl-2與Bax的表達(dá)；G：Hep3B和HepG2細(xì)胞Bcl-2/Bax的差異；1：對照組；2：4-PBA組；3：槐耳清膏組；4：槐耳清膏+4-PBA組；與對照組比較：*P<0.05；與槐耳清膏組比較：#P<0.05

4-PBA已被用于臨床中尿素循環(huán)障礙的治療且無明顯毒副作用[11]，且4-PBA能夠抑制細(xì)胞ERS的發(fā)生。本研究表明槐耳清膏與4-PBA聯(lián)合使用能夠抑制槐耳清膏誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞ERS，減輕ERS對腫瘤治療的不利影響。

本研究在驗(yàn)證槐耳清膏具有抗腫瘤作用的同時(shí)也提示槐耳清膏可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生ERS，導(dǎo)致槐耳清膏的作用下降。4-PBA能夠有效抑制ERS的發(fā)生，與槐耳清膏聯(lián)合使用降低了肝癌細(xì)胞內(nèi)ERS水平，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比值，使槐耳清膏抑制肝癌細(xì)胞活力、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。4-PBA聯(lián)合槐耳清膏與單獨(dú)使用槐耳清膏相比具有更明顯地抗腫瘤作用，可能為肝癌的治療提供新的思路。