馬牧天，譚振亞，周園琴，吳夢月，鄭 紅

骨髓增殖性腫瘤 (myeloproliferative neoplasma，MPN)是一類以一種或幾種骨髓細胞持續(xù)異常增殖為特征的疾病，被認為是髓系腫瘤的一種[1]。在病理后期可轉(zhuǎn)化為急性白血病。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶2(domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2, SHP2)是一種由Ptpn11基因編碼的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，在造血細胞的生長發(fā)育、增殖分化過程中起著十分重要的作用。多種類型的白血病患者體內(nèi)存在SHP2蛋白的異?；罨虼?，SHP2被認為是白血病的原癌基因[2-4]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白2(alanine-serine-cysteine transporter 2, ASCT2)是由Slc1a5基因編碼的中性氨基酸載體，在多種癌癥中可通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞對谷氨酰胺的攝入來影響腫瘤的發(fā)病，抑制ASCT2的表達則可有效的抑制癌細胞的惡性增殖[5-7]，但血液系統(tǒng)疾病與ASCT2相關(guān)的研究報道很少，與MPN發(fā)病機制的關(guān)系研究尚不清楚。該研究通過構(gòu)建SHP2激活突變鼠，觀察ASCT2對SHP2激活突變后致骨髓增殖性腫瘤的調(diào)控作用，為臨床治療尋找新的靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 自實驗小鼠體內(nèi)分離的原代細胞，包括小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，MSC)：MSC(Ptpn11+/+)和MSC(Ptpn11E76K/+)；造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSC): HSC(Ptpn11+/+)和HSC(Ptpn11E76K/+)。

1.1.2主要試劑 Western blot實驗抗體購自美國Cell Signaling公司；Glutamate Assay Kit購自美國Cell BIOLABS公司；DMEM、胰蛋白酶(Trypsim)購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合溶液(雙抗)購自美國Hyclone公司；PBS粉末、牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司；其他試劑和耗材均購自上海生物工程(生工)股份有限公司。

1.1.3主要儀器 細胞培養(yǎng)箱(型號ELCETRON CORPORATION)、酶標儀(型號3001)、高速低溫離心機(型號MultifugeX1R)購自美國賽默飛世爾科技公司；恒溫磁力攪拌器(型號79HW-1)、渦旋振蕩器(型號XH-89)購自樂清樂成電器廠；倒置顯微鏡(型號ECLIPSE TS100)購自日本尼康公司；凝膠成像儀(型號FC3)購自美國普諾森公司；超聲波細胞破碎儀(型號JY92-2D)購自寧波新芝科技公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物的構(gòu)建 Ptpn11E76K/+突變鼠來自美國埃默里大學血液/腫瘤系瞿成奎教授惠贈；Mx1-Cre+小鼠(C57BL/6J品系)購自上海南方模式動物中心，于安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院動物實驗中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)擴繁，于鼠齡4～5周鑒定后，對突變鼠(Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+)注射PIPC誘導。

1.2.2骨髓細胞的提取 全程無菌操作，脊柱脫臼處死小鼠后，用75%乙醇浸泡小鼠消毒3 min，自腹部將小鼠皮膚剪開并撥下下肢皮膚，選小鼠后肢自髖關(guān)節(jié)剪下，存放于無菌PBS中，將小鼠后肢轉(zhuǎn)移至細胞間。將小鼠后肢自膝關(guān)節(jié)分開，并將骨頭上的軟組織與骨頭分離干凈，留下干凈的腿骨，置于另一無菌培養(yǎng)皿中，并用PBS浸泡清洗。用5 ml注射器從小鼠腿骨兩端鉆孔，直至有落空感且針頭進入骨內(nèi)，使骨髓腔兩端都與外界相連。吸取1～2 ml無菌PBS反復從腿骨兩端沖洗骨髓腔，直至腿骨整體呈白色為止。將含有骨髓細胞的PBS轉(zhuǎn)移至EP管中，吹打均勻后，800 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，吸棄上清液，沉淀即為全骨髓細胞，可用完全培養(yǎng)基重懸細胞至培養(yǎng)皿中進行接種培養(yǎng)。

1.2.3細胞分選與培養(yǎng) HSC采用流式分選獲得；MSC利用磁珠分選獲得；MSC培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM、含1%雙抗青鏈霉素混合溶液中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.4MTT實驗法 消化培養(yǎng)皿中的細胞，并用完全培養(yǎng)基溶液(含10%FBS)配制成單個細胞懸液，計算細胞數(shù)。以每孔體積180 μl、細胞數(shù)量800～1 200個，將細胞接種至96孔板，置于37 ℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。每孔加入20 μl MTT溶液(PBS溶液配制，5 mg/ml，pH7.4)，繼續(xù)孵育4 h后，離心后棄去上清液。每孔加入150 μl DMSO，置于37 ℃環(huán)境下，震蕩10～20 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上使用490 nm波長，測定各孔吸光度(optical density, OD)，并記錄結(jié)果。

1.2.5谷氨酸檢測 將超純水和10×分析緩沖液按照9:1的比例稀釋成1×分析緩沖液。按照說明書制備反應混合物溶液，用1×分析緩沖液調(diào)整熒光探針最終濃度為100 μmol/L、HRP最終濃度為0.2 U/ml、谷氨酸氧化酶為0.08 U/ml、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶為0.5 U/ml、L-丙氨酸為200 μmol/L(反應混合物溶液可在4 ℃環(huán)境中儲存1 d)。用PBS將細胞濃度調(diào)整為1×106～2×106個 /ml，轉(zhuǎn)移細胞懸液至1.5 ml EP管中，冰上放置。使用超聲波細胞破碎儀破碎EP管中的細胞(間隔8 s，工作3 s，總時長6 min)。將L-Glutamate標準品溶液以1 ∶10的比例，用試劑盒中的1×分析緩沖液稀釋配制谷氨酸鹽標準品，配制成的每孔50 μl體積的梯度濃度標準品(谷氨酸濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0 μmol/L)加到96孔板中。每孔中加入50 μl反應混合物溶液，充分混合后，用錫箔紙完全包裹96孔板，置于37 ℃無光照環(huán)境下孵育30～45 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上使用590～600 nm的波長，測定各孔OD值，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠模型的構(gòu)建構(gòu)建模型的原理是利用了生物基因的同源修復機制，基因修飾使得一條鏈上76位點E突變?yōu)镵后的Ptpn11部分外顯子序列插入小鼠DNA中，此DNA序列同時包含有一個Neo盒并連著一個STOP位點，并且在Neo盒和STOP位點的兩端各有一個LoxP位點。此時在無Cre酶的誘導下，由于此序列中存在STOP位點，此E76K位點無法完整轉(zhuǎn)錄翻譯，該條基因鏈上的突變SHP2基因無法表達。 通過注射PIPC增加干擾素(IFN)的產(chǎn)生誘導Mx1 啟動子啟動Cre重組酶的表達，作用于插入DNA序列中LoxP位點，定向切除Neo盒和STOP位點，使得E76K突變的Ptpn11可以完全成功轉(zhuǎn)錄翻譯而誘導Ptpn11激活突變表達，見圖1A，特異性地在轉(zhuǎn)基因小鼠的造血系統(tǒng)及間充質(zhì)干細胞中實現(xiàn)了Ptpn11E76K基因的表達，此時突變小鼠體內(nèi)SHP2蛋白得以正常表達，見圖1B，插入DNA序列中的Neo盒在骨髓細胞和間充質(zhì)干細胞中約96.1%和95.4%被切除(F=47.841、56.250，P<0.001)，見圖1C。

2.2 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠發(fā)生MPN，HSC體外增殖能力增強且依賴培養(yǎng)環(huán)境中的谷氨酰胺突變小鼠PIPC注射結(jié)束約40 d后，可出現(xiàn)脾臟腫大至0.42 g(正常0.08 g)(F=34.452，P<0.01),見圖2A。骨髓及脾臟中髓系細胞增多(F=62.228、43.123，P<0.01)，見圖2B，顯示已罹患MPN。將Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+突變小鼠和Ptpn11+/+Mx1-Cre+正常小鼠體內(nèi)的HSC和MSC自骨髓中分離純化，并進行體外培養(yǎng)。利用MTT法檢測HSCs在體外的增殖能力可觀察到，突變小鼠體內(nèi)的HSCs增殖能力強于正常小鼠，見圖2C，但將培養(yǎng)基去除谷氨酰胺后，突變小鼠的HSCs增殖能力反而會弱于正常小鼠，見圖2D，提示Ptpn11E76K/+Mx1- Cre+激活突變鼠HSC的體外高增殖能力依賴于外界環(huán)境中谷氨酰胺的含量。

2.3 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠體內(nèi)谷氨酰胺的含量和ASCT2的表達量Western blot技術(shù)檢測激活突變鼠體內(nèi)ASCT2的變化，突變小鼠骨髓細胞中ASCT2的表達高于正常小鼠，并且檢測Ptpn11+/+Mx1-Cre+正常小鼠和Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠血清及細胞內(nèi)的谷氨酰胺含量,顯示突變小鼠血漿、骨髓細胞中谷氨酰胺含量高于正常小鼠(F=36.454、65.243，P均<0.01)。同時在構(gòu)成骨髓微環(huán)境的MSC中，激活突變鼠的谷氨酸是正常小鼠的3倍左右(F=62.224，P<0.01)，由于谷氨酰胺是谷氨酸的轉(zhuǎn)化前體和主要來源，在其轉(zhuǎn)化過程中谷氨酰胺被水解為谷氨酸和氨，顯示SHP2突變型白血病細胞為維持自我增殖的能量、氮源等需求，對谷氨酰胺的攝取能力增強。見圖3。

圖1 成功構(gòu)建Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠

圖2 Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠細胞體外增殖能力高度依賴谷氨酰胺的濃度

圖3 Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠的谷氨酰胺水平增高

2.4 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠的細胞能量代謝增強，能量應激及增殖相關(guān)的常見信號分子表達增強之前的實驗證明，Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠腫瘤模型ASCT2的表達增高，而且大量攝入谷氨酰胺。檢測兩組小鼠HSC內(nèi)代謝情況，顯示突變小鼠細胞上清液中乳酸水平是正常小鼠的2倍左右(F=73.46，P<0.001)，ATP產(chǎn)生是正常小鼠3倍到5倍左右(F=36.25、54.237，P<0.001 )，反映其糖酵解能力增強，見圖4A、B。同時利用Western blot技術(shù)檢測突變小鼠體內(nèi)相關(guān)蛋白的表達水平，表明突變小鼠骨髓細胞內(nèi)p-mTOR、p-AKT、p-ERK表達增強，p-mTOR/p-S6信號通路也增強，見圖4C。

2.5 抑制ASCT2對谷氨酰胺的攝取，可遏制Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠GPNA是較為常見的ASCT2拮抗抑制劑，它可以通過與ASCT2競爭性結(jié)合抑制細胞對谷氨酰胺的攝取。將Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠隨機分成兩組，分別為實驗組和抑制處理組：在對兩組小鼠注射PIPC誘導完成后，抑制處理組立即注射GPNA溶液，實驗組不做處理，持續(xù)4周，觀察兩組小鼠的情況。注射GPNA的處理組小鼠其脾臟小于未注射的小鼠(F=34.230，P<0.01)，而且其細胞內(nèi)谷氨酸含量少于實驗組(F=23.440， P<0.01)。見圖5A、B。利用Western blot技術(shù)檢測2組小鼠體內(nèi)相關(guān)蛋白的表達水平，表明抑制ASCT2后，其體內(nèi)p-mTOR表達降低，顯示p-mTOR信號通路活性被抑制，見圖5C。HE染色顯示注射GPNA溶液的處理組小鼠骨髓、脾臟、肺部和肝中炎性細胞浸潤減輕，顯示其MPN的發(fā)病進程被抑制。

圖4 Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠細胞的能量代謝增強，細胞增殖相關(guān)信號表達增強

3 討論

細胞代謝重構(gòu)是各種腫瘤細胞普遍的特征[8-9]，細胞分化和生長之間的平衡通常與新陳代謝有關(guān)，HSCs 的代謝調(diào)控日益受到關(guān)注。正常 HSC 必須定居在骨髓中低氧、低營養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境中通過激活糖酵解來保持靜息狀態(tài)[10-12]。在增殖和自我更新的過程中，需要葡萄糖、脂肪酸以及氨基酸三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝提供 ATP 供能。而腫瘤細胞主要依賴葡萄糖和谷氨酰胺。當葡萄糖的代謝途徑主要依靠糖酵解產(chǎn)生 ATP 時，谷氨酰胺就成為增殖期細胞(包括腫瘤細胞)的關(guān)鍵的能量來源,它通過代謝可以轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，進入 Krebs 循環(huán)不僅為細胞提供 ATP，還為大分子合成提供前體物質(zhì)。但谷氨酰胺必須通過載體的轉(zhuǎn)運才能進入細胞內(nèi)，其中載體 ASCT2 起重要作用。ASCT2(Slc1a5 基因編碼)是一個廣譜的中性氨基酸載體，主要轉(zhuǎn)運谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸等，為細胞代謝提供重要的營養(yǎng)底物[13-14]。雖然對谷氨酰胺載體 ASCT2 的生理學功能進行了大量的研究，病理情況下，尤其是在血液系統(tǒng)腫瘤中的調(diào)控作用相關(guān)研究并不多。關(guān)于 ASCT2 對 SHP2 激活突變后骨髓微環(huán)境及造血干細胞代謝的影響及功能調(diào)控，目前尚無報道。本課題探討了 SHP2 激活突變后ASCT2 對代謝的影響進而揭示其影響疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制。

在低糖和谷氨酰胺缺乏的情況下，干細胞會因為ATP 的缺乏很快死亡[15]。本研究顯示SHP2 激活突變后造血干細胞的體外增殖能力增強，去除了培養(yǎng)基中的谷氨酰胺后，增殖能力降低，死亡增多，表明突變細胞的增殖能力增強是谷氨酰胺依賴性的。同時突變鼠的骨髓細胞及間充質(zhì)干細胞中檢測到了高濃度的谷氨酰胺水平。進一步檢測突變鼠的骨髓細胞及間充質(zhì)干細胞中谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白 ASCT2 的表達情況，ASCT2 的蛋白表達異常增高。

進一步檢測突變鼠的代謝情況顯示ATP產(chǎn)生量增加，乳酸水平增高，同時與細胞能量應激、增殖相關(guān)的p-mTOR/ p-S6、p-AKT、p-ERK信號分子表達增強。為了證實ASCT2對骨髓造血干細胞及其微環(huán)境代謝的影響及SHP2激活突變所致白血病的靶向調(diào)節(jié)作用，課題組給突變小鼠腹腔注射ASCT2的抑制劑(GPNA)，顯示相較于未處理的突變組，抑制組小鼠的脾臟較小，骨髓、脾臟、肺及肝臟等臟器中炎性細胞浸潤減輕，發(fā)生 MPN 及白血病的幾率很少，死亡率降低。同時與能量應激相關(guān)的p-mTOR信號分子也弱于未處理的突變組，證實了谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白ASCT2在SHP2激活突變致骨髓增殖性腫瘤中的調(diào)控作用，提示ASCT2蛋白可能是一個新的治療靶點。

圖5 抑制小鼠ASCT2蛋白功能，可抑制MPN(和/或白血病)發(fā)病進程 ×20