趙贇霄，左 斌，阮長耿, 何 楊

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種以血小板減少為主要特征的出血性疾病。研究[1]表明，ITP患者體內(nèi)可檢測出針對多種血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)的自身抗體，主要包括抗GPⅡb/Ⅲa和Ⅰb/Ⅸ自身抗體[2-3]。自身抗體與血小板結(jié)合后通過其Fc段被肝脾網(wǎng)狀系統(tǒng)巨噬細胞識別吞噬，從而使血小板減少。有研究[4]表明不同自身抗體介導(dǎo)的血小板減少機制可能存在差異。抗GPⅠb自身抗體可通過Fc受體非依賴性機制使血小板減少。 因此，單一自身抗體的檢測已無法滿足ITP疾病的診斷和評估，需要同時鑒定多種自身抗體的特異性類型，以指導(dǎo)后續(xù)治療。流式免疫微球芯片技術(shù)(flow cytometricimmuno-bead array, FCIBA)以聚苯乙烯微球為載體，并用熒光加以區(qū)分同一體系中的不同微球，從而實現(xiàn)高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1ITP組 選擇2016年11月15日—2017年11月10日在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診患者共661例，其中男性249例、女性412例，年齡15～86(48.12±15.32)歲，血小板計數(shù)為(5～96)×109/L。ITP診斷依據(jù)美國血液學(xué)協(xié)會指南[5]。另跟蹤調(diào)查地塞米松治療前后患者75例，口服地塞米松40 mg/d，服用4 d。

1.1.2非免疫性血小板減少組(Non-ITP) 選擇同期在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科就診患者87例，其中男性39例、女性48例，年齡13～61(48.81±16.32)歲，血小板計數(shù)為(20～99)×109/L。包括再生障礙性貧血31例、急性淋巴細胞白血病18例、淋巴瘤17例、骨髓異常增生綜合征21例。

1.1.3正常對照組 選擇同期在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢者158例，其中男性89例、女性69例，年齡21～57(33.41±9.93)歲，血小板計數(shù)為(121～287)×109/L。

1.2 方法

1.2.1外周靜脈血采集與處理 分別采集各組外周靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝；室溫下1 000 r/min離心5 min，吸取上層富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)至1.5 ml離心管；3 000 r/min離心5 min，棄去上清液；血小板沉淀加入1 ml含0.05%EDTA的0.01 mmol/L PBS(pH7.6)，吹打混勻，3 000 r/min離心5 min，棄上清液。如此將血小板洗滌3次后，棄上清液后，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2FCIBA檢測血小板特異性自身抗體 依據(jù)He et al[6]報道的方法。用鼠源性抗GPⅨ、抗GPⅠb、抗GPⅢa、抗GPⅡb和抗P-選擇素的單克隆抗體SZ1、SZ2、SZ21、SZ22和 SZ51(本研究所制備)，分別包被于自身帶有5種不同強度APC-cy7熒光的聚苯乙烯微球(美國Spherotech公司)。采用流式細胞儀分別檢測ITP組、Non-ITP組和正常對照組GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa和P-選擇素5種自身抗體，抗體水平以平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)表示。

1.2.3改良間單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(shù)(monoclonal antibody immobilization of platelet antigens, MAIPA)檢測血小板特異性自身抗體 根據(jù)已報道的ELISA方法[7]分別檢測ITP組、Non-ITP組和正常對照組GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa和P-選擇素5種自身抗體。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。樣本間MFI比較采用獨立樣本t檢驗，地塞米松治療前后抗體水平采用單因素方差分析。采用SPSS軟件繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線并計算曲線下面積(area under the curve，AUC)以評估FCIBA所檢測的血小板抗體水平對ITP的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微球穩(wěn)定性測定于微球包被后的第1、5、10、20、60天測定微球的MFI值。SZ1、SZ2、SZ21、SZ22和SZ51 5種單克隆抗體的MFI。結(jié)果顯示包被微球在包被后第60天依然保持穩(wěn)定。

2.2 批內(nèi)、批間精密度評價

2.2.1批內(nèi)精密度 通過對同一份陽性血漿重復(fù)檢測20次，5種單克隆抗體SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51的批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.35%、 5.65%、3.41%、3.63%和3.51%。

2.2.2批間精密度 通過對同一份陽性血漿連續(xù)檢測10 d，5種單克隆抗體SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51的批間變異系數(shù)分別為10.10%、9.13%、8.04%、9.59%和10.20%。

2.3 FCIBA方法學(xué)性能評價

2.3.1敏感度 FCIBA法分析ITP組661例樣本，其中抗GPⅨ陽性率為71.0%，抗GPⅠb陽性率為82.1%，抗GPⅢa陽性率為71.7%，抗GPⅡb陽性率為71.0%，抗P-選擇素陽性率為72.0%，5種抗體聯(lián)合檢測的陽性率為89.0%。FICBA和MAIPA敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3.2特異度 FCIBA法分析Non-ITP組和正常對照組245例樣本，其中抗GPⅨ陰性率為80.4%，抗GPⅠb陰性率為80.8%，抗GPⅢa陰性率為79.2%，抗GPⅡb陰性率為76.7%，抗P-選擇素陰性率為79.2%，5種抗體聯(lián)合檢測的陰性率為66.5%。FICBA和MAIPA特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3.3精確度 FCIBA法分析總共906例樣本(3組共906例)，其中抗GPⅨ準確度為73.5%，抗GPⅠb準確度為81.8%，抗GPⅢa準確度為73.7%，抗GPⅡb準確度為72.5%，抗P-選擇素準確度為74.0%，5種抗體聯(lián)合檢測的準確度為82.9%。FICBA和MAIPA精確度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3.4ITP組、Non-ITP組和正常對照組MFI 與Non-ITP組比較，ITP組抗GPⅨ(t=7.841，P<0.01)、抗GPⅠb(t=9.266，P<0.01)、抗GPⅢa(t=8.543，P<0.01)、抗GPⅡb(t=8.336，P<0.01)、抗 P-選擇素(t=8.841，P<0.01)5種抗體的MFI均高于Non-ITP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與正常對照組比較，ITP組抗GPⅨ(t=8.282，P<0.01)、抗GPⅠb(t=12.195，P<0.01)、抗GPⅢa(t=10.414，P<0.01)、抗GPⅡb(t=9.933，P<0.01)、抗P-選擇素(t=10.268，P<0.01)5種抗體的MFI均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與正常對照組比較，Non-ITP組5種抗體的MFI差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 FICBA和MAIPA敏感度、特異度和精確度的比較 [n(%)]

表2 ITP組、Non-ITP組和正常對照組

2.4 地塞米松治療前后ITP患者自身抗體的變化75例ITP患者經(jīng)過口服地塞米松治療前后5種抗體的陽性率下降，治療后較治療前差異有統(tǒng)計學(xué)差異，抗GPⅨ(F=27.522，P<0.01)、抗GPⅠb(F=41.752，P<0.01)、抗GPⅢa(F=97.937，P<0.01)、抗GPⅡb(F=107.189，P<0.01)、抗P-選擇素(F=67.380，P<0.01)。詳見表3。

表3 地塞米松治療前后5種抗體的變化[N=75,n(%)]

2.5 ROC曲線利用SPSS軟件生成5種自身抗體的ROC曲線，見圖1。采用約登指數(shù)計算Cut-off值及最佳靈敏度和特異度。SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51共5種單克隆抗體的Cut-off值分別為9.385、20.605、17.770、17.385、15.985，對應(yīng)的AUC分別為0.827[95%CI:0.797～0.856](P<0.01)、0.904[95%CI:0.883～0.925](P<0.01)、0.843[95%CI:0.813～0.873](P<0.01)、0.835[95%CI:0.805～0.865](P<0.01)、0.841[95%CI:0.812～0.871](P<0.01)。

3 討論

ITP是一種常見的出血性疾病，以血小板數(shù)量降低為主要表現(xiàn)，并且在ITP患者的外周血中經(jīng)常可以檢測到抗血小板抗原的自身抗體[8]。通過利用流式細胞術(shù)建立一個新的檢測血小板膜糖蛋白特異性自身抗體的方法。該方法的基本原理是將5種不同的單克隆抗體包被在5種直徑為4 μm的聚苯乙烯微球上，而微球本身帶有不同熒光強度的APC-cy7，在同一反應(yīng)體系中能夠被流式細胞儀區(qū)分，從而實現(xiàn)同一分標本可以同時檢測5項指標。

圖1 5種單克隆抗體診斷ITP的ROC曲線

在本研究中，F(xiàn)CIBA方法具有60 d的穩(wěn)定性。并且該方法具有相對較小的批內(nèi)、批間差異，SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51 5種單克隆抗體的批內(nèi)差異分別為8.35%、5.65%、3.41%、3.63%和3.51%。批間差異分別為10.10%、9.13%、8.04%、9.59%和10.20%。與He et al[6]報道的方法數(shù)據(jù)基本一致。

分別采用FCIBA和MAIPA方法對ITP患者樣本中血小板自身抗體進行檢測，顯示FCIBA方法具有與MAIPA方法相當?shù)拿舾卸?，更高的特異度和準確度(表1)。臨床樣本檢測顯示ITP組相較于Non-ITP組和正常對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。同時跟蹤調(diào)查了75例口服地塞米松ITP患者治療前后5種自身抗體的變化情況。顯示地塞米松治療后自身抗體低于治療前(P<0.01，表3)，結(jié)果與文獻[9]報道一致。FCIBA法操作更簡單，耗時更少，效率更高，對患者血小板的需求量更少，具有更強的臨床適應(yīng)性，同時也能對用藥后起到監(jiān)測療效的作用。

根據(jù)ROC曲線所確定的Cut-off值，評估各自身抗體對ITP疾病的診斷效能。根據(jù)約登指數(shù)，F(xiàn)CIBA方法具有較高的敏感度、特異度。若聯(lián)合檢測5種自身抗體可大大提高檢測準確度。

該研究表明流式免疫微球技術(shù)直接檢測ITP患者血漿中的血小板自身抗體具有較高的敏感度、特異度和準確度，并且更高效便捷，能更好地適用于臨床檢測。