張勇峰，陳嵐，王希

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 洛陽 471000）

子宮內(nèi)膜癌為原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤,具有發(fā)病因素多、機(jī)制尚不明確特點(diǎn)，據(jù)報(bào)道其死亡率已達(dá)惡性腫瘤死亡率前10 位[1]。及早發(fā)現(xiàn)、早期治療對(duì)疾病預(yù)后和生存質(zhì)量至關(guān)重要，子宮內(nèi)膜活檢作為常規(guī)診斷手段對(duì)前期病變誤診率高[2]；且相關(guān)病房資料顯示目前提供給病理醫(yī)師的子宮內(nèi)膜材料較常規(guī)刮宮術(shù)更少,增加了診斷難度[3]。近年一些學(xué)者探討子宮內(nèi)膜癌前病變與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，相關(guān)蛋白分子與疾病密切相關(guān)，考慮通過評(píng)估相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)水平,可有效防治子宮內(nèi)膜癌前病變的惡性發(fā)展。半乳凝素1(Galectin-1) 作為Galectin 家族中的一員具有高度蛋白親和力,多項(xiàng)研究顯示其可在多種腫瘤細(xì)胞中異常上調(diào)[4]。近年一項(xiàng)研究表明，隨著子宮內(nèi)膜病變惡性程度增強(qiáng)或向惡性轉(zhuǎn)化，Galectin-1 和Galectin-9 表達(dá)水平均增強(qiáng)，提示Galectin 家族相關(guān)因子可能與子宮內(nèi)膜癌前病變病情進(jìn)展與預(yù)后密切相關(guān)[5]。除此之外,近年發(fā)現(xiàn)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生相關(guān)分子標(biāo)志物還有配對(duì)盒基因2 (Pairing box gene 2, PAX-2)、磷酸酶基因(Phosphatase gene, PT EN)、雌激素受體(estrogen receptor, ER)、蛋白激酶(protein kinase, PKD1)、腫瘤增殖抗原(Ki-67)等，均有可能參與子宮內(nèi)膜的癌變進(jìn)展,給臨床提供了一定依據(jù)[6,7]。但綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)和臨床資料發(fā)現(xiàn)，關(guān)于Galectin-1、PAX-2 在子宮內(nèi)膜癌前病變中的表達(dá)及其意義的報(bào)道較少, 因此本研究就此展開討論,以期明確子宮內(nèi)膜癌前病變惡性發(fā)展的預(yù)測因子，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)討論并通過和患者及家屬均簽署知情同意書后,于病理檔案室收集 2013 年 1 月-2015 年 2 月我院切除的 109 例子宮內(nèi)膜標(biāo)本,分別有28 例子宮內(nèi)膜息肉、40 例子宮內(nèi)膜增生癥(單純性增生12 例、復(fù)雜性增生9 例、非典型增生19 例)、41 例子宮內(nèi)膜癌 (Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣腺癌22 例、Ⅱ型子宮內(nèi)膜漿液性癌19 例)。子宮內(nèi)膜息肉患者年齡 26～43 歲、 平均 31.65±3.06歲,平均身體質(zhì)量指數(shù)(Body mass index, BMI)(22.96±2.78)kg/m2； 子宮內(nèi)膜增生癥患者年齡 28～68 歲、平均 40.22±3.34 歲，平均 BMI 23.52±3.11kg/m2；子宮內(nèi)膜癌患者年齡 31～75 歲、平均 46.68±3.47 歲、＜30 歲 17 例、≥30 歲 24 例, 平均 BMI23.52±3.11 kg/m2、＜18.5 kg/m226 例、≥18.5 kg/m215 例， 平均卡氏(Karnofsky, KPS)評(píng)分(82.02±2.36)分、70～80 分23 例、＞80 分 18 例， 病理學(xué)分級(jí) G1～G2 級(jí) 29 例、G3 級(jí) 12 例，I～Ⅱ期 30 例、Ⅲ～Ⅳ期 11 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴疾病診斷最終經(jīng)病理學(xué)檢查確診； ⑵子宮發(fā)育正常的女性； ⑶年齡18～45 歲； ⑷入院前均未接受放療、 化療或靶向治療； ⑸未發(fā)生全身其他部位轉(zhuǎn)移；⑹ KPS 評(píng)分≥70 分；⑺預(yù)計(jì)生存期超過1 年。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并其他惡性腫瘤；⑵依從性不好，不能定期隨訪；⑶子宮內(nèi)膜癌既往史；⑷過敏體質(zhì)或凝血功能異常； ⑸溝通障礙或嚴(yán)重精神系統(tǒng)疾??；⑹臨床資料不完整，相關(guān)檢查不完善。剔除標(biāo)準(zhǔn)：⑴依從性特別差或中途要求退出的受試者；⑵未完成治療； ⑶因疾病惡化或出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥需進(jìn)行其他治療；⑷不能獲取完整隨訪資料。

1.2 方法 采用RM2235 組織切片機(jī)(德國徠卡)將所有包蠟組織切成4 μm 連續(xù)切片,依次采用二甲苯(南通新能源物資有限公司)、檸檬酸鈉緩沖液(北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司)及3%過氧化氫溶液(北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、梯度酒精水化、PBS 緩沖液(上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)漂洗、內(nèi)源性過氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人PAX-2、Galectin-1 多克隆抗體 (濃度1：100, 購自 Santa Cruz 公司)4℃孵育過夜；PBS 漂洗, 滴加即用型生物素化二抗37℃孵育30 min；PBS 漂洗,滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育20 min；PBS 漂洗，經(jīng) DAB 顯色試劑盒(Solarlaio)顯色、蘇木精(湖南匯百侍生物科技有限公司)復(fù)染、梯度酒精脫水，透明，中性樹脂(南京森貝伽生物科技有限公司) 封片，DMM-440 倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司) 下觀察PAX-2、Galectin-1 表達(dá)。

1.3 染色判定標(biāo)準(zhǔn) 由兩名具有執(zhí)業(yè)資格的病理科醫(yī)生采用雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷和分析， 染色強(qiáng)度：0 分為不著色，1 分為淡黃色，2 分為深黃色，3 分為棕黃色； 陽性細(xì)胞百分率：0 分為陽性細(xì)胞百分率 0～5%，1 分為陽性細(xì)胞率 5～25%，2 分為陽性細(xì)胞率 26～50%，3 分為陽性細(xì)胞率 51～75%，4分為陽性細(xì)胞百分率＞75%。兩項(xiàng)之和進(jìn)行綜合判定：≤ 3 分為陰性，＞3 分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用EpiData3.1 軟件校正所有數(shù)據(jù)，spss22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料比較采用卡方(χ2)或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)，組間有序分類資料比較采用Ridit 分析； 采用Kendall’s tau-b法檢驗(yàn)等級(jí)資料相關(guān)性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAX-2 表達(dá)情況 PAX-2 主要定位于細(xì)胞核中，呈黃色或棕黃色顆粒；PAX-2 陽性表達(dá)率在Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣腺癌組織、 Ⅱ型子宮內(nèi)膜漿液性癌組織、子宮內(nèi)膜增生癥組織、子宮內(nèi)膜息肉組織中依次升高(P＜0.05)，見表 1、圖 1。

表1 PAX-2 陽性表達(dá)率[n(%)]

圖1 PAX-2 陽性表達(dá)圖

2.2 Galectin-1 表達(dá)情況 Galectin-1 主要定位于細(xì)胞漿中，部分可于細(xì)胞核中表達(dá)，呈黃色或棕黃色顆粒；Galectin-1 陽性表達(dá)率在Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣腺癌組織、Ⅱ型子宮內(nèi)膜漿液性癌組織、子宮內(nèi)膜增生癥組織、 子宮內(nèi)膜息肉組織中依次下降 (P＜0.05)，見表 2、圖 2。

2.3 PAX-2、Galectin-1 表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌前病變病情進(jìn)展的關(guān)系 等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，PAX-2陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜增生癥呈負(fù)相關(guān)(r=-0.360,P＜0.05)，Galectin-1 陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜增生癥呈正相關(guān)(r=0.553，P＜0.05)。

表2 Galectin-1 陽性表達(dá)率[n(%)]

圖2 Galectin-1 陽性表達(dá)圖

2.4 PAX-2、Galectin-1 表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征關(guān)系 PAX-2 在 BMI≥18.5 kg/m2、 病理學(xué)G3 級(jí)、 分期I～Ⅱ期組織中陽性表達(dá)率高于BMI＜18.5kg/m2、病理學(xué) G1～2 級(jí)、分期Ⅲ～Ⅳ期組織中陽性表達(dá)率 (P＜0.05)，Galectin-1 在病理學(xué) G3 級(jí)、分期I～Ⅱ期組織中陽性表達(dá)率低于病理學(xué)G1～2 級(jí)、分期Ⅲ～Ⅳ期組織中陽性表達(dá)率(P＜0.05，表3)。

3 討論

Galectin 家族有 15 個(gè)成員, 包括 Galectin-1～Galectin-15, 均由一組與β-半乳糖苷具有高度親和力的動(dòng)物凝集素蛋白組成,決定其具有影響細(xì)胞黏附、生長、凋亡、增殖、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤作用等多種生物學(xué)功能。張廣云等[8]文獻(xiàn)指出，Galectin-3 在膀胱癌組織切片中陽性表達(dá)率高于正常組織；Van 等[9]發(fā)現(xiàn) Galectin-1 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中表達(dá)上調(diào),該患者五年生存率更低；Wang 等[10]敲除Galectin-1 基因后發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌耐藥性提高，提示Galectin-1 可誘導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥性；綜合上述研究可得Galectin-1 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展。這早在既往研究中已得到證實(shí)，Galectin-1 可在卵巢癌、卵巢上皮癌、子宮頸癌等多種惡性腫瘤組織呈高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲與生長。本研究結(jié)果顯示，Galectin-1 在Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣腺癌組織、Ⅱ型子宮內(nèi)膜漿液性癌組織、子宮內(nèi)膜增生癥組織、子宮內(nèi)膜息肉組織中陽性表達(dá)率依次為 90.91%、84.21%、32.99%、0.00%，可看出子宮內(nèi)膜的惡化程度與Galectin-1 表達(dá)水平有正相關(guān)關(guān)系，且在正常子宮內(nèi)膜中Galectin-1 完全不表達(dá)。該表達(dá)率較低于Noda 等[11]理論，考慮與本研究樣本量較少有關(guān),另可能與選取的均為回顧病例有關(guān)。結(jié)合既往報(bào)道，提示Galectin-1 可參與腫瘤細(xì)胞發(fā)生和進(jìn)展,其高表達(dá)提示子宮內(nèi)膜癌前病變可向惡性發(fā)展或呈惡性程度增高趨勢。盒子基因家族成員之一PAX-2 對(duì)促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腎等胚胎和器官發(fā)育具有重要價(jià)值,也可參與多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生與發(fā)展。PAX-2 具有保守的DNA 序列基序,包含128 個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)的氨基末端部分，決定其的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。陸春燕等[12]文獻(xiàn)表明，PAX-2 在成熟組織中多不表達(dá)，而在成人子宮內(nèi)膜中呈持續(xù)表達(dá),提示其參與子宮內(nèi)膜增生和自我更新。祁曉莉等[13]探討PAX-2 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn), 子宮內(nèi)膜癌組織中PAX-2 表達(dá)水平低于正常子宮內(nèi)膜組織, 提示PAX-2 在惡性腫瘤細(xì)胞中可呈表達(dá)缺失狀態(tài)。該機(jī)制主要與其對(duì)基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄作用有關(guān),對(duì)細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生抑制,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移及分化。本研究中PAX-2 陽性表達(dá)率與Galectin-1 表達(dá)率相反，其表達(dá)缺失提示預(yù)后不良。吳銀霞等[14]的一項(xiàng)膀胱癌大樣本隨訪資料顯示，Galectin-1 陽性患者術(shù)后五年生存率顯著低于Galectin-1 陰性患者，且當(dāng)并存遠(yuǎn)處淋巴轉(zhuǎn)移時(shí)，Galectin-1 陰性患者術(shù)后五年生存率也和無轉(zhuǎn)移患者無顯著差異,這一研究結(jié)果證實(shí)了Galectin-1 對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)展和預(yù)后的預(yù)測。本研究中子宮內(nèi)膜惡性程度越高而Galectin-1 表達(dá)越強(qiáng)，參考吳銀霞的結(jié)果，提示Galectin-1 可作為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌前病變疾病進(jìn)展的分子標(biāo)志物。

表3 PAX-2、Galectin-1 表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征關(guān)系

為進(jìn)一步明確Galectin-1、PAX-2 表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的預(yù)測價(jià)值, 我們將Galectin-1、PAX-2 表達(dá)水平與不同組織類型子宮內(nèi)膜病變及子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析， 結(jié)果Galectin-1 表達(dá)與疾病惡性發(fā)展呈正相關(guān)關(guān)系，而PAX-2 表達(dá)與疾病惡性發(fā)展呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。且Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣腺癌PAX-2 表達(dá)陽性率顯著低于Ⅱ型子宮內(nèi)膜漿液性癌, 說明PAX-2 與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)病相關(guān)性更大。在子宮內(nèi)膜病變?cè)缙?、無淋巴轉(zhuǎn)移時(shí)，Galectin-1 表達(dá)率低而PAX-2 表達(dá)率高, 說明PAX-2 缺失和Galectin-1 強(qiáng)表達(dá)可能發(fā)生在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病早期階段,這對(duì)于早期相關(guān)分子的檢測和控制有較高價(jià)值。分析其作用機(jī)制可得，PAX-2 和抑癌基因具有相似結(jié)構(gòu)，共同參與正常子宮內(nèi)膜生長,其水平下降或缺失直接影響子宮內(nèi)膜正常生長和功能。而Liu 等[15]報(bào)道指出,子宮正常生長功能被破壞后,原癌基因和抑癌基因發(fā)生變化, 誘發(fā)癌癥可能性大。相關(guān)報(bào)道均對(duì)Galectin-1表達(dá)水平作出證實(shí)，其在正常組織中幾乎不表達(dá)，而一旦組織發(fā)生病變,其敏感性高于其他特異性指標(biāo)[16,17]。

綜上，PAX-2、Galectin-1 表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌前病變及子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，檢測該指標(biāo)可簡單、方便判斷子宮內(nèi)膜癌前病變嚴(yán)重程度，對(duì)子宮內(nèi)膜癌及其癌變病變?cè)缙谠\斷、指導(dǎo)臨床治療及評(píng)估預(yù)具有重要價(jià)值。