徐振興 ，黃利堅(jiān) ，王秀麗 ，滕菁 ，梁偉真

（福建省廈門市中醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.肝病中心，福建 廈門 361009）

乙型肝炎病毒(HBV)嚴(yán)重威脅人類健康，目前對(duì)于HBV 的認(rèn)識(shí)已取得較大進(jìn)展。近年來(lái)的研究初步揭示了血清HBVRNA 的性質(zhì)，提示其以病毒樣顆粒形式存在與患者血清中，與肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 存在相關(guān)性，可能反映抗病毒療效等。但是血清HBVRNA 在慢性HBV 感染不同臨床類型中的分布如何少有報(bào)道。本文旨在通過(guò)研究CHB 患者血清中HBVRNA 的檢出情況，探討血清HBVRNA的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 2018 年1 月至2019 年8 月在我院肝病中心診治的住院及門診患者,從中選取477 例資料完整的病例，按病因分為5 組,見(jiàn)表1,其中關(guān)于慢性 HBV 攜帶者、HBeAg 陽(yáng)性 CHB、HBeAg 陰性CHB 和非活動(dòng)性HBsAg 攜帶者病例的診斷符合慢性乙型肝炎防治指南(2015 更新版)[1]，CHB 治療后HBsAg 陰轉(zhuǎn)者的納入標(biāo)準(zhǔn)為CHB 治療后連續(xù) 2 次（至少間隔 3 個(gè)月）血清 HBsAg＜0.05IU/ml。

1.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 空腹抽取患者靜脈血5ml，一小時(shí)內(nèi)分離血清,-20℃保存待測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)血清HBVRNA, 檢測(cè)系統(tǒng)為安普利GeneLight9800 核酸分析系統(tǒng), 試劑為北京熱景生物技術(shù)有限公司乙型肝炎pgRNA 檢測(cè)試劑盒。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。HBVRNA 的檢測(cè)下限為300copies/ml，其檢測(cè)有效性判定：每批次檢測(cè)均用試劑盒自帶陰陽(yáng)性對(duì)照作為定性質(zhì)控，陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增曲線符合典型“S”形；定量標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足斜率在-3.0 和-3.5 之間以及 r2＞0.98。

表1 477 例病例分組情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 CHB 患者血清HBVRNA 陽(yáng)性率與HBeAg、HBVDNA 陽(yáng)性率的相關(guān)性分析及不同分組間HBVRNA 陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，HBVRNA 含量與HBVDNA 含量先分別進(jìn)行Log10轉(zhuǎn)換，再采用Pearson 相關(guān)作相關(guān)性分析。以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同CHB 患者血清 HBVRNA 陽(yáng)性率 HBVRNA 陽(yáng)性率從大到小排序?yàn)椋篐BeAg 陽(yáng)性CHB組 55.5%(66/119)、 慢性 HBV 攜帶者組 42.2%(46/109)、 非活動(dòng)性 HBsAg 攜帶者組 28.3%(32/113)、HBeAg 陰性 CHB 組 10.4%(11/106)以及 CHB 治療后HBsAg 陰轉(zhuǎn)者組6.7%(2/30)，總陽(yáng)性率為32.9%(157/477)；各組間差異有顯著性(χ2=66.48,P=0.000)。

2.2 血清 HBVRNA 陽(yáng)性率與 HBeAg、HBVDNA 陽(yáng)性率的相關(guān)性,見(jiàn)表2。HBeAg 陽(yáng)性組的HBVRNA陽(yáng)性率（49.1%，112/228）顯著高于 HBeAg 陰性組（18.1%,45/249）（P=0.00）；HBVDNA 陽(yáng)性組的 HBVRNA 陽(yáng)性率（36.5%，124/340）顯著高于 HBVDNA 陰性組（24.1%，33/137）（P=0.01）

表2 血清HBVRNA 陽(yáng)性率與HBeAg、HBVDNA 的關(guān)系

2.3 血清HBVRNA 含量與HBVDNA 含量的相關(guān)性。在所有組別中,對(duì) HBVRNA 與 HBVDNA 同時(shí)陽(yáng)性的的數(shù)據(jù)進(jìn)行Log10 轉(zhuǎn)換后分析，結(jié)果表明它們之間存在一定的相關(guān)性（r=0.264，P=0.008）。見(jiàn)圖1。

圖1 血清HBVRNA 含量與HBVDNA 含量的關(guān)系

3 討論

血清HBVRNA 成分已被證實(shí)為3.5kb 的病毒前基因組 RNA（pregenomeRNA，pgRNA），來(lái)源于未完全轉(zhuǎn)錄而遺留的pgRNA,也可能為核衣殼包裹的pgRNA 在未啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄步驟的情況下直接獲得包膜并從感染的肝細(xì)胞中釋放出來(lái),以病毒樣顆粒形式存在[2，3]?；诤塑疹愃莆铮∟As）不能抑制 cccDNA 轉(zhuǎn)錄生成mRNA,理論上可以推斷pgRNA 與cccDNA 水平相關(guān),血清中HBVRNA 可以反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 水平，因此已有較多的研究者認(rèn)為血清HBVRNA 可作為潛在的NAs 治療的新標(biāo)記物，用以指導(dǎo)患者核苷和核苷酸類藥物安全停藥的指標(biāo)等[4,5,6]。

我們對(duì)不同臨床類型CHB 患者血清HBVRNA 的陽(yáng)性率進(jìn)行了調(diào)查, 發(fā)現(xiàn)HBeAg 陽(yáng)性CHB組＞慢性HBV 攜帶者組＞非活動(dòng)性HBsAg 攜帶者組＞HBeAg 陰性 CHB 組＞CHB 治療后 HBsAg 陰轉(zhuǎn)者組，各組間差異有顯著性（χ2=66.48，P=0.000）。這一結(jié)果表明血清HBVRNA 與患者的免疫狀態(tài)、HBV 的復(fù)制情況以及肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān),也提示在評(píng)估NAs 停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)方面值得深入研究[7,8]。

有研究結(jié)果表明HBeAg 狀態(tài)可影響血清HBVpgRNA 與 cccDNA 的相關(guān)性，HBeAg 陽(yáng)性患者的血清HBVRNA 水平與肝內(nèi)cccDNA 呈顯著相關(guān)，但HBeAg 陰性患者的血清HBVRNA 水平與肝內(nèi) cccDNA 無(wú)相關(guān)性[9]。本文 HBeAg 陽(yáng)性組的 HB VRNA 陽(yáng)性率(49.1%，112/228)顯著高于 HBeAg 陰性組（18.1%，45/249）（P=0.00），提示血清 HBVRNA與HBV 的復(fù)制程度相關(guān)，同時(shí)進(jìn)一步表明HBeAg陰性患者仍有可能存在病毒復(fù)制,具有較強(qiáng)的傳染性。

本研究中，HBVDNA 陽(yáng)性組的HBVRNA 陽(yáng)性率 （36.5%，124/340） 顯著高于 HBVDNA 陰性組（24.1%，33/137）（P=0.01），這一結(jié)果表明血清 HBVRNA 與HBVDNA 的聯(lián)合應(yīng)用能較好的反映慢性肝炎患者的HBV 感染狀態(tài)。對(duì)于HBVDNA 陰性的血清而言，其檢出的HBVRNA 可能是未參與轉(zhuǎn)錄而直接釋放入血清的包被顆粒,也可能是抗病毒藥物抑制了逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程而后使得HBVRNA 釋放入血。這需要對(duì)此類患者作較長(zhǎng)時(shí)間隨訪檢測(cè)來(lái)證實(shí)，但這也間接提示血清 HBVDNA 小于檢測(cè)下限可能僅代表了病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程被抑制,并不能反映 cccDNA 的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA仍會(huì)以 HBVRNA 病毒樣顆粒的方式產(chǎn)生子代病毒。因此HBVRNA 可能作為較好的監(jiān)測(cè)持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答及肝細(xì)胞核內(nèi) cccDNA 池的耗竭的潛在指標(biāo)[10]。

本研究對(duì)HBVRNA 和HBVDNA 的血清濃度值進(jìn)行Log10 轉(zhuǎn)換后作相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管它們之間存在一定的相關(guān)性(P=0.008),但相關(guān)程度較低(r=0.264)。這可能進(jìn)一步提示血清HBVRNA 既可能來(lái)源于轉(zhuǎn)錄所剩的核酸顆粒 (與HBVDNA 一起反應(yīng)HBV 的復(fù)制狀態(tài))，也可能是來(lái)源于阻斷逆轉(zhuǎn)錄后的核酸顆粒(反應(yīng)抗病毒的效果或停藥的指標(biāo))。

綜上所述,血清HBVRNA 可能與肝細(xì)胞內(nèi)ccc DNA 轉(zhuǎn)錄活性有關(guān),在抗病毒療效的考核以及CH B 患者的臨床管理方面有著一定的意義。本研究的局限性在于沒(méi)有調(diào)查血清HBVRNA 與肝功能受損情況以及與HBcrAg、隱匿性乙肝的關(guān)系。