劉敏，馬芬

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 開封475000）

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥,其特征在于腎功能的進(jìn)行性惡化[1]。同時，早期生物標(biāo)志物的鑒定將有助于提高疾病的診斷的準(zhǔn)確性,闡釋糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制。目前，尿液中的多種miRNA分子可作為疾病的特異性生物標(biāo)志物[2]。miRNA 被包裝在外泌體和凋亡小體中，具有高度的穩(wěn)定性，使其即使脫離細(xì)胞內(nèi)環(huán)境亦可抵抗RNase 的降解作用[3,4]。Nassirpour R 等人[5]通過對糖尿病腎病患者的尿液樣本進(jìn)行高通量miRNA-seq 測序和生物信息學(xué)分析,成功鑒定了多個差異表達(dá)的且有可能成為標(biāo)志物的 miRNA, 包括 miR-133b，miR-342 和miR-30a,但該團(tuán)隊尚未進(jìn)一步確定上述miRNA 的臨床診斷價值。因此，本研究旨在探討尿液中檢測miR-342，miR-30a 和 miR-133b 對糖尿病腎病的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入 2015 年 10 月至 2018 年 10月我院收治的糖尿病腎病患者30 例，其中男性15例,女性 15 例，平均年齡 52.4±13.3 歲；糖尿病非腎病患者30 例，其中男性13 例，女性17 例，平均年齡53.2±14.2 歲。所有患者均經(jīng)我院兩名專家確診。拒絕標(biāo)準(zhǔn)：⑴患有精神疾病者；⑵患有或既往患有各類惡性腫瘤者。同時，納入2015 年10 月至2018 年10 月我院接收的健康體檢志愿者，其中男性 15 例，女性 15 例，平均年齡 52.8±10.8 歲。研究開始前獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),入組患者和志愿者均簽署知情同意書。

1.2 Real-time qPCR 采集所有受試人員中段晨尿30 mL。按照制造商說明書規(guī)范，使用TRIzol 溶液（Invitrogen）從血液中提取RNA。使用Prime Script RT Master Mix 將 500ng RNA 反向轉(zhuǎn)錄為 cDNAs。使用 SYBR Select Master Mix 在 ABI 7500 系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR 實驗并分析結(jié)果。使用內(nèi)參基因U6 歸一化，計算函數(shù)為 2-ΔΔCT，引物序列見表 1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 R Studio 軟件進(jìn)行相關(guān)分析，三組受試個體的尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 指標(biāo)比較采用 t 檢驗，用表示。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分析尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的臨床診斷價值。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受試者尿液中 miR-133b，miR-342 和miR-30a 的表達(dá)量比較 觀察組、非腎病組和對照組尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達(dá)量均存在顯著差異（P＜0.05），見表 2。

表2 3 組人員尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的表達(dá)量

2.2 觀察組與非腎病組尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 分析 為了評估m(xù)iR-133 b，miR-342 和miR-30a 在觀察組與非腎病組中的診斷價值，繪制 ROC 曲線,見圖 1。miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲線下面積分別為 0.90±0.04 （95%CI 0.8266～0.9779）、0.79±0.07 （95%CI 0.6568～0.9143）、0.84±0.06(95%CI 0.7334～0.9577)，以miR-133b 的臨界值1.338, 其診斷靈敏度為80%，特異度為90%；以miR-342 的臨界值2.063，其診斷靈敏度為83%，特異度為83%；以miR-30a 的臨界值2.018, 其診斷靈敏度為87%, 特異度為87%。見圖 1 和表 3。

圖1 觀察組與非腎病組尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲線

2.3 觀察組與對照組尿液中miR-133b，miR-342和 miR-30a 的 ROC 分析 為了評估 miR-133b，miR-342 和miR-30a 在觀察組與對照組中的診斷價值，繪制 ROC 曲線,見圖 2。miR-133b，miR-342和 miR-30a 的 ROC 曲線下面積為 0.87±0.05（95%CI 0.7742 to 0.9724）、0.86±0.05 （95%CI 0.7614 to 0.9742）、0.87±0.04 （95%CI 0.7846 to 0.9709）,以miR-133b 的臨界值1.077，其診斷靈敏度為83%，特異度為93%；以miR-342 的臨界值1.110，其診斷靈敏度為87%，特異度為87%；以miR-30a 的臨界值1.093，其診斷靈敏度為83%，特異度為87%。見圖 2 和表4。

圖2 觀察組與對照組尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲線

2.4 檢測尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a對糖尿病腎病的診斷價值 患有糖尿病腎病患者樣本的為真陽性（以病理結(jié)果作為參照）,未患有糖尿病腎病的為真陰性(以非腎病組為參照)。以miR-133b 的臨界值 1.338、miR-342 的臨界值 2.063、miR-30a 的臨界值2.018 進(jìn)行串聯(lián)方式的聯(lián)合診斷。靈敏度=真陽性個體數(shù)/（真陽性個體數(shù)+假陰性個體數(shù)）×100%，特異度=真陰性個體數(shù)/（真陰性個體數(shù)+假陽性個體數(shù)）×100%， 準(zhǔn)確度=（真陽性個體數(shù)+真陰性個體數(shù)）/總個體數(shù)×100%。檢測尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 三聯(lián)檢測對診斷糖尿病腎病的靈敏度為77%（23/30）, 特異度為93 %（28/30），準(zhǔn)確度為 92%（55/60）。

表3 觀察組與非腎病組尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

表4 觀察組與對照組尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

表5 檢測尿液中miR-133b，miR-342和miR-30a 對糖尿病腎病的診斷價值

3 討論

全球約9%的成年人罹患糖尿病[6-8],其中約40%的Ⅰ型糖尿病患者可發(fā)生糖尿病腎病，Ⅱ型糖尿病患者中亦有并發(fā)糖尿病腎病[9]。存在腎病合并癥的患者面臨腎功能障礙風(fēng)險的概率更高,如缺血性腎病等[10]。據(jù)報道，某些miRNA 與包括腎癌和多囊腎病在內(nèi)的多種腎臟疾病存在相關(guān)性[11-13]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者的尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的三者聯(lián)合檢測可提高對糖尿病腎病診斷的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度。

miRNA 主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后沉默的作用, 具有高度保守、內(nèi)源性，片段較短（19～25 個核苷酸）等特點[14]。多項研究旨在表征它們作為生物標(biāo)志物的潛力[16]。在本研究中，糖尿病腎病患者的尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達(dá)量均高于糖尿病非腎病患者和健康體檢者（P＜0.05），糖尿病非腎病患者尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達(dá)量高于健康體檢者(P＜0.05)。據(jù)報道,miR-133b是腎腫瘤的抑制因子[17]，在多囊腎病患者中含量失調(diào)[18]。Wang 等人也發(fā)現(xiàn)，miR-133b-3p 在老年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的微泡中下調(diào)表達(dá),顯著抑制 HK2 細(xì)胞中 TGF-β1 介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]，提示該分子可能在纖維化中發(fā)揮作用。miR-342 被證實在I 型和II 型糖尿病中均存在上調(diào)表達(dá)[20]，在患有活動性腎炎的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中顯著降低[21]，提示尿miR-342 的表達(dá)異常與腎病存在相關(guān)性。miR-30 家族的異常表達(dá)可致足細(xì)胞凋亡，蛋白尿腎病和腎小球硬化等[22]。尿液中miR-30a 的水平與局灶節(jié)段性腎小球硬化的活動有關(guān),并且對類固醇治療效果有一定提示意義[23],說明尿液中miR-30a 的表達(dá)水平是腎病預(yù)后的潛在標(biāo)記物。糖尿病腎病患者和糖尿病非腎病患者的miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的靈敏度分別為 80%，83%和87%；特異度分別為90%，83%和87%；廣圣芳等人[24]發(fā)現(xiàn) Hcy、Cys-C、SOD 作為診斷糖尿病腎病的生物標(biāo)志物時靈敏度、 特異度及準(zhǔn)確度分別為85.3%、82.7%及84.2%。在本研究中，尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 三聯(lián)檢測對診斷糖尿病腎病的靈敏度為77%，特異度為93%，準(zhǔn)確度為92%。因此,尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a聯(lián)合診斷的特異度和靈敏度均高于中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值，顯示了其較好的診斷效能。

糖尿病從發(fā)展到糖尿病腎病共歷經(jīng)五個階段，第一階段高血糖狀態(tài)下，腎臟逐漸肥大，腎小球呈高濾過狀態(tài)，未出現(xiàn)尿蛋白現(xiàn)象[25]。既往糖尿病腎病診斷指標(biāo)中,尿蛋白從第二階段起才可作為診斷糖尿病腎病的靶標(biāo)。因此，進(jìn)一步探討尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達(dá)水平與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的五個階段的關(guān)系是下一步的研究方向。盡管miR-133b, miR-342, miR-30a的單向診斷或兩兩聯(lián)合診斷的靈敏度均高于三者聯(lián)合診斷，但是，其特異度均小于三者聯(lián)合診斷。此外,單個分子可作為多種疾病的標(biāo)志物,比如miR-133b 可作為急性心肌梗死的生物標(biāo)志物[26], miR-342 可作為急性髓細(xì)胞白血病的生物標(biāo)志物[27]，miR-30a 可作為缺血性卒中的生物標(biāo)志物[28]。使用單個分子進(jìn)行診斷時,如果患者患有此分子可診斷的其他疾病，就會造成大量的誤診。因此，尿液中miR-133b，miR-342, miR-30a 三者的聯(lián)合診斷能夠更加特異性的針對糖尿病腎病。

綜上所述,尿液中miR-133b,miR-342 和miR-30a 聯(lián)合檢測可作為診斷糖尿病腎病的潛在標(biāo)志物。