羅云杰，成守金

（1.焦作煤業(yè)（集團）有限責任公司中央醫(yī)院核醫(yī)學科；2 焦作煤業(yè)（集團）有限責任公司中央醫(yī)院檢驗科，河南 焦作454000）

據(jù)流行病學研究顯示，2015 年我國新發(fā)的392.39 萬例惡性腫瘤病例中, 新發(fā)乳腺癌占30.8萬例，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤疾病首位[1]?，F(xiàn)有研究證實，乳腺癌發(fā)生發(fā)展涉及多種癌基因、抑癌基因、非編碼DNA 等的調控，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展,尋找乳腺癌相關分子診斷標志物及靶向治療成為臨床研究熱點[2-4]。溶酶體相關4 次跨膜蛋白B(lysosome-associated protein transmembrane-4 beta,LAPTM4B)是新近發(fā)現(xiàn)的具癌基因特性的新腫瘤相關基因[5]，在膠質瘤[6]、前列腺癌[7]等多種惡性腫瘤疾病中存在過度表達現(xiàn)象， 參與腫瘤發(fā)生、 發(fā)展及浸潤轉移。臨床也不乏LAPTM4B與乳腺癌的關系類報道，如Rusz 等[8]雌激素受體(estrogen receptor,ER) 陰性的乳腺癌患者癌組織LAPTM4B 基因拷貝數(shù)與蒽環(huán)類化療不良反應具正相關關系。鑒于此，本研究擬著重分析乳腺癌癌組織中新腫瘤相關基因LAPTM4B 的表達水平及臨床意義，以期為LAPTM4B 在乳腺癌中深入應用提供參考，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集 2019 年 1 月-2020 年 3 月在本院接受乳腺癌手術治療的患者乳腺癌組織病理標本87 例，每例標本均留存有癌組織及癌旁組織，其中癌旁組織為距離癌組織5cm 處的形態(tài)學正常的乳腺組織。納入標準：⑴經乳腺癌組織病理學確診乳腺癌；⑵留存有乳腺癌癌組織及癌旁組織（距癌組織5cm 以上的癌旁組織）標本；⑶臨床資料及病歷資料能滿足研究需要。排除標準：⑴組織標本采集前接受過乳腺癌相關放療、化療、內分泌治療或靶向治療。

1.2 方法 材料與試劑盒：乳腺癌癌組織標本均來源于本院手術切除的乳腺癌及癌旁正常組織，-80℃凍存的新鮮標本；Trizol 試劑盒（Takara 公司）；NanoDrop One 超微量紫外分光光度計 （上海鯨舟基因科技有限公司）；逆轉錄聚合酶鏈式反應(RTPCR)試劑盒（普洛麥格北京生物技術有限公司）；LAPTM4B 引物序列（上海桑尼有限公司合成)。

LAPTM4B mRNA：乳腺癌癌組織標本均來源于本院手術切除的乳腺癌及癌旁正常組織，-80℃凍存的新鮮標本。研磨組織后經氯仿抽提，10%乙酸銨及無水乙醇沉淀后溶于TE，4℃保存，DNA 則于-20℃長期保存；參照 Trizol 試劑盒說明書提取R NA, 紫外分光光度計測定A260、A280 并計算其含量，逆轉錄調整 RNA 至終濃度 20μg/μl；而后參照逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA 逆轉錄合成，RNA模板 2μg，PCR 反應體系：2.0μg 10×緩沖液、0.5μl dNTP、 上游引物及下游引物各 0.5μl、0.5μlDNA Taq 酶切、15μl ddH2O 及 1μl 模板。PCR 反應條件：95℃預變性 15min、95℃30s、58℃45s、72℃60s，共計 28 個循環(huán)，72℃延伸 10min； 以 β-actin 為內參， 擴增產物經1.2%瓊脂糖凝聚電泳后可在電泳條帶中出現(xiàn) 241bp、318bp 兩條 DNA 片段；2-△△Ct法計算LAPTM4B mRNA 水平。LAPTM4B 上游引物：5'-GGTGGTTTAAAGTATTGTAATTGA-3'； 下游：5'-AACCTTCCTTCTTTCATCTAAC-3'。

1.3 統(tǒng)計學方法 SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料行正態(tài)分布其方差齊性檢驗， 不符合正態(tài)分布則采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）描述，非參數(shù)秩和檢驗；計數(shù)資料采用例（%）描述，2 檢驗；Logistic 回歸分析 LAPTM4B mRNA 水平的影響因素；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 87 例乳腺癌患者均為女性， 年齡33～69 歲，其中＞60 歲 56 例，≤60 歲 31 例；導管浸潤性乳腺癌62 例，非導管浸潤性乳腺癌25 例；腫瘤直徑 14～64mm，其中＞20mm 40 例，21～50mm 29例，＞50mm 18 例；42 例合并腋窩淋巴結轉移；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期50 例，Ⅲ～Ⅳ期37 例；雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性39 例，孕激素受體(progesterone receptor,PR)陽性42 例、人表皮生長因子受體-2 (human epidermal growth factor receptor-2,HE R2)陽性45 例、增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,Ki-67)陽性 23 例。

2.2 乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 水平 乳腺癌癌組織中LAPTM4B mRNA 水平為0.89（0.23,1.12）,顯著高于癌旁組織的 0.17（0.03,0.66），差異有統(tǒng)計學意義（Z=7.814，P＜0.001），見圖 1。

圖1 乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 表達

2.3 不同病理特征的乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 水平 將乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 水平按中位數(shù)分高水平組（≥0.89，n=52）、低水平組（＜0.89，n=35）；不同年齡、腫瘤大小、ER 表達、PR 表達、HER2 表達的乳腺癌患者癌組織LAPT M4B mRNA 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,但導管浸潤性、 淋巴結轉移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、Ki-67陽性的乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 高水平比例分別顯著高于非導管浸潤性、 無淋巴結轉移、M 分期Ⅰ～Ⅱ期、Ki-67 陰性患者， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 不同病理特征的乳腺癌患者癌組織 LAPTM4B mRNA 表達（例，%）

2.4 乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 水平的Logistic 回歸分析 將病理分型（導管浸潤性=1、非導管浸潤性=0）、淋巴結轉移（有=1、無=0）、TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期=1、Ⅲ～Ⅳ=2）、Ki-67（陽性=1、陰性=0）作為協(xié)變量，LAPTM4B mRNA 水平（高水平=1、低水平=0）作為因變量行Logistic 回歸分析，結果顯示乳腺癌患者病理分型、淋巴結轉移、TNM 分期及Ki-67 表達均是LAPTM4B mRNA 水平的獨立影響因素，見表2。

表2 乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 水平的Logistic 回歸分析

3 討論

2015 年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病,占女性惡性腫瘤疾病的60%，死亡率則占所有女性人的15%，也是導致45 歲以下女性死亡的主要原因之一, 嚴重危害女性健康[9]?，F(xiàn)階段乳腺癌的治療主要以手術配合放化療等著綜合治療為主,但放化療藥物存在多藥耐藥現(xiàn)象。隨著分子生物學技術的發(fā)展，探尋可作為治療靶點的分子生物學標記物于提升乳腺癌治療療效，并減輕化療毒性至關重要。LAPTM4B 位于人染色體8q22.1，由7 個外顯子及6 個內顯子組成，廣泛表達于機體組織。在婦科腫瘤疾病中，丁麗君等[10]證實子宮內膜癌患者癌組織LAPTM4B 蛋白存在異常高表達現(xiàn)象，認為LAPTM4B 蛋白與腫瘤分化程度、 淋巴結轉移均是子宮內膜癌預后的獨立影響因素。LAPTM4B 不僅調控細胞增殖、凋亡等生物學行為中扮演重要角色，且參與腫瘤多藥耐藥，但LAPTM4B 在乳腺癌中的表達及其臨床意義類報道相對少見[11,12]。

往期研究報道，LAPTM4B 可激活P13K/AKT信號通路上調凋亡相關蛋白表達，如Bcl-2，并下調促凋亡蛋白Bax 表達, 使正常細胞發(fā)生惡性轉化，促進惡性腫瘤疾病發(fā)生，在肝癌、前列腺癌、子宮內膜癌等多種腫瘤疾病中具可見LAPTM4B 異常高表達現(xiàn)象[13]。本研究顯示,乳腺癌癌組織LAPT M4B mRNA 水平顯著高于癌旁組織, 提示LAPTM 4B mRNA 在乳腺癌組織中呈過表達現(xiàn)象, 是乳腺癌中的過表達基因。這與往期報道結論相符[14]。為進一步分析LAPTM4B mRNA 表達在乳腺癌中的臨床意義, 本研究將乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 水平按中位數(shù)分高表達組、低表達組；結果顯示雖不同年齡、腫瘤大小、ER 表達、PR 表達、HE R2 表達的乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義,但導管浸潤性、淋巴結轉移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、Ki-67 陽性的乳腺癌患者癌組織LAPTM4B mRNA 高水平比例分別顯著高于非導管浸潤性、無淋巴結轉移、M 分期Ⅰ～Ⅱ期、Ki-67陰性患者。由此可見，LAPTM4B mRNA 水平與病理分型、淋巴結轉移、TNM 分期、Ki-67 表達密切相關。Logistic 回歸分析也證實了上述結果，顯示乳腺癌患者病理分型、淋巴結轉移、TNM 分期及Ki-67表達均是LAPTM4B mRNA 水平的獨立影響因素。

分析LAPTM4B mRNA 在乳腺癌中的作用機制，LAPTM4B mRNA 可通過上調 Cyclin D1、Cyclin E 表達促進細胞從G1 期進入S 期，促進惡性細胞證實； 另其也激活 integrin-α6 街道 P13K-AKT 信號通路、上調原癌基因表達參與細胞增殖及凋亡[15,16]。Meng 等[17]報道 LAPTM4B 缺失可導致增殖細胞核抗原、血管內皮生長因子、MMP2、MMP9 和CDK 12 表達降低，認為LAPTM4B 可能與卵巢癌細胞侵襲特征存在密切關聯(lián),或可成為卵巢癌治療的潛在治療靶點。隋思蕾等報道也顯示乳腺癌中LAPT M4B 僅與淋巴結轉移及TNM 分期相關，與腫瘤大小、脈管浸潤、年齡、ER、PR、HER2 表達均無顯著關聯(lián)。這與本研究結論相似。但呂楊等[18]報道，LAP TM4B 表達水平僅與乳腺癌家族史有一定相關性，與分子分型、臨床分期等均無顯著關聯(lián)，這與本研究結論存在差異。本研究中所有患者均無乳腺癌家族史， 因而未將家族史作為臨床特征納入研究范圍， 另考慮可能與研究對象個體差異或樣本量差異有關，這也在一定程度上反映LAPTM4B 與乳腺癌病理特征的關系仍有待補充及完善。

綜上所述, 乳腺癌癌組織中新腫瘤相關基因LAPTM4B mRNA 表達高于癌旁癥狀組織，且乳腺癌病理分型、淋巴結轉移、TNM 分期及Ki-67 表達均是LAPTM4B mRNA 表達的獨立影響因素。