耿 貴，劉 鈺，李任任，楊瑞瑞，路正禹，於麗華，王宇光

（1黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境，哈爾濱 150080）

0 引言

連作障礙(continuous cropping obstacles)是指正常管理條件下，同一土地上栽培同種或同科作物持續(xù)2年或2年以上，引起作物產(chǎn)質(zhì)量降低、病蟲害發(fā)生加劇等不良反應(yīng)的現(xiàn)象[1-2]。連作障礙是化感自毒物質(zhì)的積累、土壤微生物區(qū)系的改變等諸多因素綜合作用的結(jié)果，在糧食作物（玉米[3]、高粱[4]、馬鈴薯[5]）、經(jīng)濟作物（棉花[6]、花生[7]、烤煙[8]）、藥用植物（當歸[9]、人參[10]、三七[11]）、果蔬類（黃瓜[12]、番茄[13]）等中均有不同程度的體現(xiàn)，造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[14-15]。

研究表明，連作種植同樣也會影響糖料作物甜菜的產(chǎn)質(zhì)量。甜菜(Beta vulgaris)是中國重要的糖料作物[16]，作為制糖的原材料，具有很高的經(jīng)濟價值。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜連作4年之后糖度下降可達6.5℃，根產(chǎn)量下降甚至可達50%，品質(zhì)嚴重下降，且連作時間越長，其下降幅度越大，個體長勢越差，根產(chǎn)量也越低[17]。甜菜屬于忌連作的直根系深根作物，連作種植不僅會導致立枯病、根腐病等土傳病害發(fā)生率增加，還會嚴重影響甜菜產(chǎn)質(zhì)量。大量研究表明，甜菜連作后產(chǎn)生的連作障礙已嚴重制約了國內(nèi)甜菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因多年連作而產(chǎn)生的糖度下降、產(chǎn)量降低、病蟲害加劇等一系列問題已不容忽視[18-20]。田間條件下，化感物質(zhì)的釋放及作用等往往受到很多自然因素和非自然因素的綜合制約[21-23]，因此本研究采用室內(nèi)土培的方法對比休閑土和重茬土，采用固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC/MS)的方式對土壤中的化感物質(zhì)進行了鑒定分析，避免了在田間條件下各種因素的干擾，同時避免使用有機化學溶劑萃取分離等前處理方式對土壤中原有化感成分造成的干擾。筆者研究休閑土和重茬土對甜菜幼苗生長的差異性，并篩選甜菜疑似化感物質(zhì)，以期為進一步研究甜菜化感效應(yīng)、減輕甜菜連作障礙提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用甜菜種子為‘H004’品系，供試土壤材料取自黑龍江大學呼蘭校區(qū)。取樣深度為10～30 cm，采用多點隨機取樣的方式，除去石子、植物殘體等雜物后混合均勻，取一小部分置于-80℃超低溫冰箱保存（用于SPME-GC/MS分析），剩下的土壤置于4℃低溫條件保存（用于盆栽試驗）。不同土壤的基本理化性狀見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 本試驗采用盆栽方式，在黑龍江大學農(nóng)學樓光照培養(yǎng)室內(nèi)進行，培養(yǎng)室條件為每日光照14 h，溫度為(25±1)℃，夜間10 h，溫度為(20±1)℃，相對濕度為60%～70%。試驗共設(shè)置休閑土（甜菜地附近的休閑土壤）、重茬土（種植過一茬甜菜的土壤）2個處理組，每個處理設(shè)置8個重復。每盆先放1200 g土壤，均勻放入15粒甜菜種子后，再用300 g土覆蓋。定期補充水分，更換處理位置，保證所有處理的常規(guī)管理一致。種子發(fā)芽期間每天統(tǒng)計各試驗組的發(fā)芽數(shù)和病株數(shù)，定期定量補充改良Hoagland營養(yǎng)液，發(fā)芽結(jié)束后定期進行間苗，每盆保留5株幼苗，生長至28天時進行基本形態(tài)指標的測定。對土壤進行取樣，采用SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)對2種土壤進行比較分析，篩選導致甜菜連作障礙的疑似化感物質(zhì)。

1.2.2 發(fā)芽率和病株率統(tǒng)計 發(fā)芽率是指發(fā)芽終期（前12天內(nèi)）正常發(fā)芽粒數(shù)占全部種子數(shù)的百分比；病株率為該處理所有重復處理中甜菜病株數(shù)占已發(fā)芽幼苗總株數(shù)的比值。

1.2.3 生長指標測定 游標卡尺測量甜菜幼苗根莖粗；直尺測定甜菜幼苗株高，以植株心葉到葉片尖端的距離為準；使用WinRHIZO掃描軟件分析幼苗葉面積；從根莖部將幼苗剪下，電子天平獲取幼苗地上部質(zhì)量。

1.2.4 土壤樣品GC-MS分析 檢測儀器包括氣相色譜(Agilent 7890B)、質(zhì)譜儀(Agilent 5977B)，色譜柱為Agilent DB-Wax。試驗試劑為2-辛醇（純度≥99.5%）。

（1）代謝物提取。稱取5 g土壤于20 mL頂空瓶中，再加入10 μL 2-辛醇為內(nèi)標。以隨機順序進行GC-MS檢測。（2）上機檢測。Agilent 7890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-Wax毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm，J&WScientific，F(xiàn)olsom，CA，USA)。（3）GC-MS具體分析條件：萃取溫度80℃；預熱時間15 min；萃取時間30 min；解析時間4 min；分流模式為Splitless Mode；隔墊吹掃流速3 mL/min。（4）數(shù)據(jù)處理：使用ChromaTOF軟件和NIST庫對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊、質(zhì)譜匹配等分析。人工分析后使用NIST05譜庫進行質(zhì)譜匹配等分析，以確定樣品中所檢測出的各組分的化合物結(jié)構(gòu)及名稱。以P值小于0.05為標準進行2組土壤中差異有機物的篩選。

表1 供試土壤的基本理化性狀

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS軟件進行單因素方差分析結(jié)果，均用“平均值±標準差”表示，P＜0.05為差異顯著判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤種植條件下甜菜種子發(fā)芽率和病株率的比較

各處理中，甜菜播種后第5天開始發(fā)芽，第10天發(fā)芽基本完成。由表2可知，休閑種植中甜菜種子的平均發(fā)芽數(shù)均13粒，發(fā)芽率為86.67%，連作種植中甜菜種子發(fā)芽總粒數(shù)為12粒，發(fā)芽率為85.83%。不同土壤處理組對甜菜種子的平均發(fā)芽數(shù)和發(fā)芽率影響不大。

由表3可以看出，連作種植的幼株發(fā)病率較高，達到8.74%，而休閑種植的幼株病株率僅為1.92%，連作土壤種植組甜菜種子的病株率明顯高于休閑土壤種植組。

2.2 不同土壤種植條件下甜菜生長指標的比較

從圖1可以看出，與休閑種植相比，連作種植會導致甜菜幼苗的株高、葉面積和地上部鮮重顯著降低（P＜0.05，下同），其中株高降低了6.06%，葉面積減少了5.71%，地上部鮮重顯著降低了16.93%。但對莖粗的影響不大，未達到顯著水平(P＞0.05)。

2.3 不同處理土壤的SPME-GC/MS分析結(jié)果

為探究休閑土和重茬土根系分泌物的差異，篩選鑒別出導致甜菜連作障礙的疑似化感物質(zhì)，采用氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用(GC-MS)方法對2種土壤中的化學成分進行檢測。得到2種土壤SPME-GC/MS分析的離子流圖（圖2）。

根據(jù)SPME-GC/MS的化學成分分析結(jié)果，比較分析2種土壤中的差異代謝物。經(jīng)歸一化處理后進行分析，在本試驗所設(shè)置的土壤處理中，共得到約765種化學成分，以P值小于0.05為標準進行篩選，獲得共15種疑似化感物質(zhì)的化合物（表4），可分為酯類、醛類、酮類、醇類、酸類、胺類等類別。

3 結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)連作種植對甜菜種子的發(fā)芽率無影響，但會極大提高甜菜幼苗立枯病發(fā)病率，并且影響甜菜幼苗生長，以休閑土和重茬土為試驗材料，經(jīng)過比較篩選共獲得15種差異顯著的化學物質(zhì)，有待于進一步深入研究。目前關(guān)于化感作用的研究多集中于實驗室控制試驗，雖然在最大程度上避免了多種外界因素的干擾，但還是具有一定的局限性，如只能觀察一個或幾個關(guān)鍵時期、研究一種或幾種關(guān)鍵化感物質(zhì)，如何進行綜合性、全方位、長周期、多尺度的對化感物質(zhì)進行研究，仍是未來需要解決的問題。

表2 不同處理條件下甜菜種子發(fā)芽數(shù)及發(fā)芽率的比較

表3 不同處理條件下甜菜種子發(fā)芽過程中病株數(shù)及病株率的比較

圖1 不同土壤處理對甜菜各項生長指標的影響

圖2 不同土壤的SPME-GC/MS分析總離子流圖

4 討論

連作障礙是作物、土壤、微生物等多種因素綜合作用的結(jié)果[20]。在本研究中，各處理組甜菜種子發(fā)芽率在85.00%～88.33%之間，連作處理并未對甜菜種子的發(fā)芽產(chǎn)生明顯影響，而甜菜連作后，幼株立枯病的發(fā)病率明顯升高，這與魏良民等[17]對甜菜連作的田間試驗研究結(jié)果一致。同時，甜菜幼苗株高、葉面積以及地上部鮮重顯著降低，李艷紅等[24]推測是由于前茬作物根系分泌、植株殘茬腐解等作用積累了大量化感物質(zhì)，作用于幼株根部后，影響了幼株地上部的正常生長，同時使得土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)、酶活性降低，不僅導致土壤質(zhì)量降低，還造成甜菜幼株生長不良、生物量降低。

本研究將休閑土和重茬土經(jīng)過GC-MS分析，以P＜0.05為條件進行差異代謝物的篩選，共獲得15種疑似化感物質(zhì)的化合物，其中鄰苯二甲酸丁-3-己酯與標準譜庫匹配程度最高，達到958，其保留時間也較長，可能是與鄰苯二甲酸功能相關(guān)的一種新的化感物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸能夠抑制植物根系吸收水分和養(yǎng)分的能力，還能破壞植株生物膜結(jié)構(gòu)、減弱植株抗逆能力[25]。另外發(fā)現(xiàn)其衍生物如鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)[26]、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)等[27]，能夠作為植物根系分泌物中重要的化感物質(zhì)，影響種子發(fā)芽、幼苗生長或根系生理代謝等活動，且對不同植物表現(xiàn)出不同的化感促進或化感抑制作用，推測鄰苯二甲酸丁-3-己酯可能也是鄰苯二甲酸的一種衍生物，具有以上類似的生理功能。苯甲醛作為酚酸類化感物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的酚酸類化感物質(zhì)能夠影響植物光合作用和酶活性、抑制種子萌發(fā)和植物吸收養(yǎng)分等活動[28-30]。本試驗鑒定所得結(jié)果中還有幾種無法確定化學結(jié)構(gòu)的成分，尚需進一步研究，這些可能被歸為化感自毒物質(zhì)范疇的化學成分是否在甜菜及其他生物生長過程中起作用，具體是如何作用的，作用閾值濃度，作用效果，還需進行進一步的研究。此外，本研究僅對種植過一茬甜菜的土壤進行了相關(guān)初步研究，而導致作物連作障礙的因素眾多，甜菜連作障礙也可能會受到包括環(huán)境條件等在內(nèi)的其他因素影響，針對這些可能的影響因素，今后應(yīng)進行進一步的深入分析，同時對甜菜連作多年的土壤進行相關(guān)研究，并從多個角度出發(fā)去探求克服甜菜連作障礙的措施，以實現(xiàn)甜菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

表4 P值小于0.05的15種疑似化感物質(zhì)