賈永娟，劉杏立，雒 琴，王小蘭，倪君君

北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司，北京 100011

維生素A(VA)和維生素E(VE)都屬于脂溶性維生素，是維持人體正常生理功能所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且不能在人體內(nèi)合成，需從食物中獲取[1-2]。VA具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)抵抗力、預(yù)防夜盲癥以及癌癥等作用，且對(duì)骨骼牙齒的發(fā)育和皮膚的光滑程度有著重要影響[3]；VE具有抗衰老、護(hù)膚以及抑制腫瘤等功效，并對(duì)習(xí)慣性流產(chǎn)、動(dòng)脈粥樣硬化等起到預(yù)防作用[4]。但是體內(nèi)VA、VE水平過(guò)高或過(guò)低均不利于身體健康[5-6]。因此，開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)血清中VA、VE水平的快速、高效的方法對(duì)及時(shí)調(diào)節(jié)體內(nèi)VA、VE水平是十分必要的。

近年來(lái)，VA、VE的檢測(cè)方法主要有分光光度法[7]、氣相色譜法[8]、液相色譜法[1,9-10]和質(zhì)譜法[11-12]等。其中，高效液相色譜法以靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備便宜易推廣的優(yōu)勢(shì)已成為檢測(cè)VA、VE的主要方法。高效液相色譜法檢測(cè)又分為二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)法和熒光檢測(cè)器(FLD)檢測(cè)法，但是鮮有報(bào)道對(duì)兩種方法進(jìn)行詳細(xì)對(duì)比。本研究分別用這兩種檢測(cè)器(DAD、FLD)對(duì)血清中的VA、VE進(jìn)行檢測(cè)，并在線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度等方面進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)器均適用于檢測(cè)人血清中VA、VE水平，檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 高效液相色譜儀、熒光檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器(日本島津儀器有限公司)，紫外分光光度計(jì)[尤尼柯(上海)儀器有限公司]，多管渦旋混合器(北京踏錦科技有限公司)，離心機(jī)(Sigma公司)，氮?dú)獯祾邇x(杭州奧盛儀器股份有限公司)。

1.2試劑 VA、VE標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)，VA、VE乙酯(Sigma公司)，蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，無(wú)水乙醇(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，正己烷(北京頤豐天成科技有限公司)，甲醇(默克股份有限公司)。

1.3色譜條件 熒光檢測(cè)器的色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 (2.1 mm×50.0 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇/水，流速1 mL/min。熒光檢測(cè)器檢測(cè)VA和VE的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為325、294 nm 和470、328 nm。二極管檢測(cè)器的色譜柱為Waters SunFireTMC18 (2.1 mm×100.0 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相為甲醇/水，流速0.3 mL/min，檢測(cè)VA和VE的波長(zhǎng)分別為325 nm和292 nm。

1.4血清標(biāo)本預(yù)處理 將100 μL血清及其內(nèi)標(biāo)溶液置于1.5 mL的離心管中，加入100 μL蒸餾水稀釋?zhuān)瑴u旋；再依次加入無(wú)水乙醇、正己烷，渦旋，離心；取上清液并吹干，加入100 μL甲醇復(fù)溶，渦旋溶解；放入棕色瓶中備用。

1.5方法學(xué)比較

1.5.1線性關(guān)系 配制系列水平的VA和VE標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別用FLD和DAD進(jìn)行色譜分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2精密度 取適量配制好的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，再分別用DAD和FLD進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.5.3回收率 在血清標(biāo)本中添加3種水平(VA 0.125、0.5、2.0 mg/L，VE 1.25、5.0、20.0 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(簡(jiǎn)稱(chēng)加標(biāo))，按照血清標(biāo)本預(yù)處理步驟進(jìn)行回收試驗(yàn)，空白對(duì)照標(biāo)本及每個(gè)水平加標(biāo)標(biāo)本重復(fù)3次，并分別用FLD和DAD進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4殘留 取高水平的供試品溶液，用FLD和DAD進(jìn)行檢測(cè)分析；分析結(jié)束后，再對(duì)一份空白溶劑(甲醇)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5DAD和FLD的一致性和相關(guān)性 取正常16份血清進(jìn)行預(yù)處理制備供試品溶液，并用FLD和DAD進(jìn)行檢測(cè)，釆用Medcalc18.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，使用Bland-Altman點(diǎn)圖法分析FLD、DAD兩種檢測(cè)方法的一致性；Passing-Bablok回歸法分析相關(guān)性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 釆用Medcalc18.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，使用Bland-Altman點(diǎn)圖法分析FLD、DAD兩種檢測(cè)方法的一致性；Passing-Bablok回歸法分析相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1線性關(guān)系 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如表1所示，線性相關(guān)系數(shù)(r)在0.999以上。

表1 FLD和DAD檢測(cè)血清中VA、VE的線性方程

2.2精密度 供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果如表2所示：FLD、DAD檢測(cè)時(shí)，VA的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.18%、0.91%；VE 的RSD為1.19%、0.49%。

表2 FLD和DAD檢測(cè)血清中 VA、VE的精密度

2.3回收率 空白標(biāo)本和3種加標(biāo)水平標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果如表3所示：FLD檢測(cè)法的回收率為89.9%～104.7%，RSD≤3.60%；DAD檢測(cè)法的回收率為91.7%～103.2%，RSD≤2.91%。

表3 FLD和DAD檢測(cè)VA、VE的加標(biāo)回收分析

續(xù)表3 FLD和DAD檢測(cè)VA、VE的加標(biāo)回收分析結(jié)果

2.4殘留 殘留的考察結(jié)果顯示，目標(biāo)分析物在色譜圖的相應(yīng)保留時(shí)間處均未出現(xiàn)目標(biāo)峰。

Passing-Bablok回歸法分析結(jié)果如圖2和圖3：VA的回歸直線方程為Y=-0.006 723 +0.970 2X，斜率B為 0.970 2(95%CI:0.913 5～1.045 3)，截距A為-0.006 723(95%CI:-0.042 05～0.026 16),P=0.49。VE的回歸直線方程為Y=-0.489 6+0.992 4X，斜率B為0.992 4(95%CI:0.940 1～1.049 5)，截距A為-0.489 6 (95%CI:-1.329 5～0.203 1)，P=0.49。由此結(jié)果可得：VA、VE回歸直線的斜率95%CI均包含1，截距的95%CI均包含0，P>0.05。

表4 FLD和DAD檢測(cè)16份血清中VA、VE水平的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(mg/L)

注：A為FLD圖，B為DAD圖。

注：A為Bland Altman點(diǎn)圖，B為Passing-Bablok圖。

注：A為Bland Altman點(diǎn)圖，B為Passing-Bablok圖。

3 討 論

VA、VE作為重要的脂溶性維生素，是人體所必需的微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。正常情況下，健康人群血清中VA 水平為0.30～0.36 mg/L，VE水平為5.0～20.0 mg/L，兒童血清中的VE水平稍低，平均為(5.3±1.3)mg/L[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，VA的缺乏和水平降低會(huì)增加?jì)胗變撼Ｒ?jiàn)哮喘性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13]；VA、VE水平對(duì)孕婦和胎兒的健康起著至關(guān)重要的影響[14]。因此，人體內(nèi)VA、VE水平的檢測(cè)對(duì)預(yù)防嬰幼兒疾病以及孕婦的營(yíng)養(yǎng)指導(dǎo)等具有一定的臨床意義。

目前，VA、VE的檢測(cè)方法已有10余種。比色法：通過(guò)顯色反應(yīng)定量，簡(jiǎn)單、快速，但顯色不穩(wěn)定且干擾大，現(xiàn)已不常用；分光光度法：作為過(guò)去常用的方法，成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、易推廣，但只能測(cè)定總含量，不能定量各同分異構(gòu)體及其同系物，選擇性差；熒光法：根據(jù)熒光強(qiáng)度定量，特異性強(qiáng)、干擾少、靈敏快速簡(jiǎn)單，但測(cè)定值與總VE值有偏差，更適用于檢測(cè)以α-VE為主體的標(biāo)本；電化學(xué)法、色譜法：快速、靈敏、高效，現(xiàn)已成為常用的分析手段。而色譜法中的高效液相色譜法已成為VA、VE檢測(cè)的主流，其突出特點(diǎn)：(1)快速、高效，可同時(shí)分離包括同分異構(gòu)體在內(nèi)的多種化合物；(2)靈敏、特異性強(qiáng)，可用FLD、DAD等；(3)操作簡(jiǎn)單、快速。

因此，本文建立了高效液相色譜法對(duì)血清中的VA、VE水平進(jìn)行檢測(cè)，并將高效液相色譜法的FLD和DAD進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示：在考察范圍內(nèi)，F(xiàn)LD和DAD的檢測(cè)結(jié)果均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，且表現(xiàn)出良好的精密度以及良好的相關(guān)性和一致性。所以?xún)煞N高效液相色譜法均適用于檢測(cè)血清中VA、VE水平。然而，從檢測(cè)色譜圖中可以看出，F(xiàn)LD比DAD分析時(shí)間短、專(zhuān)屬性強(qiáng)、基質(zhì)干擾較少。因此，F(xiàn)LD更能滿(mǎn)足臨床標(biāo)本周期短、批量檢測(cè)的要求，且節(jié)能、高效。