沙艷偉

廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院/福建省廈門市婦幼保健院男科，福建廈門 361003

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是最常見的遺傳性腎臟疾病，患者多在成年后發(fā)病，群體中發(fā)病率為1/1 000[1]。ADPKD是由蛋白激酶D1(PKD1)(約85%的病例)或蛋白激酶D2(PKD2)(約15%的病例)突變引起的[2]。PKD1基因定位于16號(hào)染色體的短臂上(16p13.3)，由51個(gè)外顯子組成。 cDNA編碼區(qū)是由12 912個(gè)核苷酸(NM_001009944.2)組成，并編碼4 303個(gè)氨基酸[3]。PKD1基因編碼的多囊蛋白-1(PC1)水平降低可導(dǎo)致ADPKD的臨床特征[4]。囊腫的發(fā)生和擴(kuò)大是由于管狀細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡紊亂、膜蛋白細(xì)胞極性的改變、細(xì)胞外基質(zhì)缺陷、異常的液體分泌和纖毛功能異常引起的，從而導(dǎo)致腎臟增大、間質(zhì)纖維化[5]。本研究采用高通量靶向基因捕獲測序發(fā)現(xiàn)PKD1基因新剪切位點(diǎn)突變，通過家系病史和文獻(xiàn)分析，確定PKD1突變?yōu)橹虏』颍F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集1 個(gè)ADPKD家系(圖 1)。先證者(Ⅱ1)，女，36歲，結(jié)婚10年，因其“多囊腎”避孕至今未生育，2019年3月就診于本科室進(jìn)行生殖遺傳咨詢。超聲檢查提示：腎臟超聲可見雙腎體積及形態(tài)正常，腎實(shí)質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)無數(shù)個(gè)大小不一的無回聲區(qū)(圖2)，最大的為1.6 cm×1.3 cm，集合系統(tǒng)未見異常。先證者父親因多囊腎導(dǎo)致腎衰竭、尿毒癥，已去世。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，患者及家屬均已簽署知情同意書，在本院行靶向序列捕獲聯(lián)合高通量測序，并進(jìn)行基因檢測和分析。

圖1 患者家系圖

圖2 患者腎臟超聲圖

1.2方法

1.2.1DNA提取 抽取受試者及對照者靜脈血2 mL，按照試劑盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，德國)流程提取基因組DNA。

1.2.2目標(biāo)序列捕獲與測序 利用Covaris LE220超聲波儀(Massachusetts，美國)將基因組DNA打斷成200～250 bp的片段，隨后進(jìn)行Ampure Beads純化，將純化后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、加“A”以及加接頭反應(yīng)，從而完成單個(gè)患者的DNA建庫。Non-Captured樣品進(jìn)行連接介導(dǎo)PCR(LM-PCR)，純化，利用定制的基因片段捕獲芯片(Roche NimbleGen，Madison，USA)，與10～20個(gè)標(biāo)記好的患者DNA庫47 ℃雜交64～72 h，雜交結(jié)束后進(jìn)行芯片的洗滌和洗脫反應(yīng)，隨后進(jìn)行Captured樣品的LM-PCR反應(yīng)。文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer 和 ABI StepOne進(jìn)行片段大小、濃度、富集度的檢測，最后利用高通量測序儀Illumina HiSeq2500 Analyzers(Illumina，SanDiego，USA)連續(xù)雙向測序90個(gè)循環(huán)，用Illumina Pipeline software(version 1.3.4)讀出原始測序數(shù)據(jù)[6]。

1.2.3序列分析 數(shù)據(jù)下機(jī)后進(jìn)入信息分析部分。首先對下機(jī)的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行測序質(zhì)量評估，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的reads。隨后用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner)[7]與HG19進(jìn)行序列比對，與此同時(shí)進(jìn)行序列捕獲效果評價(jià)，用SOAPsnp[8]軟件和Samtools[9]軟件分別進(jìn)行單核苷酸變異(SNV)和插入缺失(Indel)的查詢，生成目標(biāo)區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(NCBI dbSNP,HapMap,1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)的比對，并對找出的可疑突變進(jìn)行注釋、篩選[6]。

1.2.4Sanger測序 對于所發(fā)現(xiàn)的致病突變，在其所在片段上、下游設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對產(chǎn)物做Sanger測序，所得結(jié)果與PKD1基因標(biāo)準(zhǔn)序列GRCh37/hg19進(jìn)行比對，從而驗(yàn)證基因芯片捕獲和高通量測序的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1基因測序結(jié)果 先證者(Ⅱ1)血標(biāo)本行PKD1、PKD2和多囊性肝腎疾病1(PKHD1)基因的全部外顯子、外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)行靶向捕獲及高通量測序，結(jié)果為先證者PKD1基因存在剪切位點(diǎn)突變，即c.12138+1G>A雜合突變(圖3)。因其父親因多囊腎去世，無法驗(yàn)證，其母親未見PKD1基因上存在c.12138+1G>A雜合突變，與Sanger測序驗(yàn)證結(jié)果一致，同時(shí)查閱人類基因突變數(shù)據(jù)庫專業(yè)版及特異性位點(diǎn)突變數(shù)據(jù)庫未見PKD1基因上存在c.12138+1G>A雜合突變。

圖3 患者及其母親Sanger測序圖

2.2突變致病性分析 通過在ExAC數(shù)據(jù)庫中搜索c.12138+1G>A位點(diǎn)的等位基因頻率，筆者發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)變異的頻率極低，為0.000 008 689，因此該位點(diǎn)是極為罕見的突變位點(diǎn)，也暗示其致病性。該剪接位點(diǎn)突變可能引起兩種剪接改變，第一種由于c.12138+1G>A位點(diǎn)突變后，其所在的內(nèi)含子無法被剪接，因此該段內(nèi)含子保留下來，使得c.12138之后的序列導(dǎo)致移碼，形成新蛋白p.Leu4047Valfs*179；第二種可能的剪接方式為將c.12138+1G>A位點(diǎn)旁的外顯子與該位點(diǎn)所在的內(nèi)含子一起被當(dāng)作內(nèi)含子剪接下來，導(dǎo)致c.12004_12138del;p.4002_4046del。因此無論采取哪種剪接方式，均會(huì)對PKD1蛋白的功能造成嚴(yán)重影響。

3 討 論

ADPKD的臨床特征是在腎臟中形成并生長出充滿液體的囊腫，這些囊腫壓迫鄰近的腎小管，導(dǎo)致腎損傷和纖維化。ADPKD致病基因有PKD1、PKD2和PKD3。本研究對先證者進(jìn)行這3個(gè)基因的測序檢測，發(fā)現(xiàn)PKD1基因存在c.12138+1G>A剪切突變，該突變位點(diǎn)目前尚未見報(bào)道。該位點(diǎn)在健康人群中突變概率極低。ADPKD的分子機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種信號(hào)通路失調(diào)和多種細(xì)胞過程的畸變，包括細(xì)胞增殖、液體分泌增加、細(xì)胞凋亡和腎小管上皮細(xì)胞不完全分化等[8]。PC1是由PKD1編碼的大蛋白質(zhì)，具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及細(xì)胞外區(qū)域，提示細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)中的相互作用，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域提示信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，并且可與多囊蛋白-2(PC2)相互作用。PC2相對分子質(zhì)量較小，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，可作為具有鈣通透性的陽離子通道，并可調(diào)節(jié)PC1，這些蛋白質(zhì)及與囊性腎病相關(guān)的許多其他蛋白質(zhì)均定位于原始纖毛，這充當(dāng)了腎臟中的流量傳感器作用[9]；大多數(shù)纖毛相關(guān)基因突變會(huì)導(dǎo)致腎囊性疾病[10]。有研究顯示初級纖毛由Hedgehog (Hh)介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，其以組織依賴性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化[11]。在規(guī)范的途徑中，Hh配體與纖毛上Hh受體蛋白Patched-1(PTCH1)結(jié)合，激活Smoothened(SMO)信號(hào)傳感器，該信號(hào)最終轉(zhuǎn)導(dǎo)到膠質(zhì)瘤(GLI)信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子的下游，該轉(zhuǎn)錄的中介體也調(diào)節(jié)纖毛[12]。纖毛的形成依賴于一種纖毛特有的纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(IFT)運(yùn)輸系統(tǒng)，IFT復(fù)合體沿著纖毛的軸絲雙向運(yùn)動(dòng),運(yùn)輸纖毛形成和維持所需要的物質(zhì)，在小鼠模型中，大多數(shù)IFT-B蛋白的丟失導(dǎo)致纖毛缺失或發(fā)育遲緩和無法應(yīng)答Hh信號(hào)[10]。相反，IFT-A蛋白缺失，導(dǎo)致在纖毛的遠(yuǎn)端末端球狀結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)累積和增強(qiáng)Hh通路的激活[13-14]。在腎臟或胚胎發(fā)育晚期中IFT-B或A基因缺失會(huì)導(dǎo)致腎囊腫[15]。PKD1 基因突變導(dǎo)致的多囊腎為常染色體顯性遺傳，患者生育后代有50%的概率遺傳并致病，如本例患者生育可選擇產(chǎn)前診斷或植入前遺傳學(xué)診斷預(yù)防后代發(fā)生多囊腎。

綜上所述，PKD1是導(dǎo)致ADPKD的常見基因，其致病機(jī)制較為復(fù)雜，本研究報(bào)道了一個(gè)PKD1新剪切突變位點(diǎn)，為ADPKD診療提供理論依據(jù)。