王文曉,李小偉,*黃文廣,楊君瓏

1 寧夏大學農學院, 銀川 750021

2 寧夏草原工作站, 銀川 750021

荒漠的生存條件極端惡劣,卻擁有豐富的微生物資源[1]。由于荒漠生態(tài)系統(tǒng)特殊的環(huán)境,土壤微生物學特性方面的研究備受研究方法的限制[2]。有關土壤微生物群落多樣性的研究主要集中在草地[3]、森林[4]、濕地[5]等生態(tài)系統(tǒng),對荒漠生境土壤微生物群落多樣性的研究相對較少。近年來,隨著測序技術的不斷發(fā)展,荒漠土壤微生物生態(tài)學研究逐漸開展起來,研究區(qū)域涵蓋中國西北地區(qū)[6],其中根際微生物的生物多樣性、植物-土壤-根際微生物間的互作、根際微生物的群落結構和功能調控等成為研究的熱點[7- 8]。根際土壤細菌是土壤微生物主要的組成部分,參與多種生化反應,在土壤有機物分解、腐殖質形成、養(yǎng)分轉化與吸收等過程中扮演著重要角色,其特性是表征土壤基質變化的敏感指標。因此,根際土壤細菌群落組成和變化成為土壤生態(tài)學的熱點研究方向之一[9]。

沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)隸屬豆科沙冬青屬,為亞洲中部荒漠特有種[10],為古地中海第三紀孑遺植物,是國家三級瀕危保護植物,主要分布在寧夏中北部、內蒙古西部及甘肅中東部等荒漠地區(qū)[11],多生長在沙丘、河灘沙地、砂礫土生境,是荒漠優(yōu)勢種之一,也是西北荒漠生境中唯一常綠闊葉灌木,具有地上部冠幅大、分枝多、抗逆性強等生物學特性,在水土保持和防治荒漠化方面作用顯著,是西北荒漠優(yōu)良的防風固沙樹種之一[12]。近年來,對沙冬青的研究主要集中在生理生態(tài)[13]、抗逆生理[14]、群落區(qū)系組成與結構特征[15]、遷地保護及瀕危原因[16]等方面,但有關沙冬青根際土壤微生物群落方面的報道很少,現(xiàn)有的研究是基于傳統(tǒng)的計數(shù)法和生物化學方法[17],研究的尺度僅限于一個或少數(shù)幾個樣地[18]。新一代高通量測序技術被廣泛應用于微生物群落結構和物種組成分析,為大尺度和深層次的土壤微生物群落結構分析提供了保障[19]。因此,探明沙冬青根際細菌群落多樣性以及影響因素,對揭示沙冬青適應極端干旱環(huán)境的機理,穩(wěn)定和改善荒漠生態(tài)系統(tǒng)有重要意義。本研究采用高通量測序技術,擬對荒漠生境中沙冬青根際土壤細菌群落多樣性與生態(tài)因子的關系進行分析。

2 材料與方法

2.1 研究區(qū)概況

本研究區(qū)域為104°47′42.72″—107°9′2.52″E,36°16′35.76″—41°46′36.84″N,海拔范圍在1023—1883 m之間。主要包括寧夏中北部地區(qū),內蒙古西部的戈壁荒漠及甘肅中條山附近,該區(qū)屬溫帶大陸性氣候,年平均氣溫在6.76—11.21℃之間,年均降雨量在105—389 mm之間,年均蒸發(fā)量大于2000 mm,該區(qū)土壤基質主要為沙質、礫質和黏土質土壤,此類土壤保水保肥能力弱,土壤貧瘠。本研究依據(jù)沙冬青自然分布情況選擇了26個典型群落作為樣地,基本涵蓋了沙冬青的分布范圍(圖1),沙冬青樣地的植物群落特征詳見表1。

圖1 蒙古沙冬青采樣點分布圖Fig.1 Distribution of sampling plots for A.mongolicusA1—A26：蒙古沙冬青群落樣地 Community plots for A.mongolicus

表1 蒙古沙冬青采樣點群落特征Table 1 Community characteristics of A.mongolicus sampling sites

2.2 研究方法

2.2.1土壤取樣

2018年8月,在沙冬青分布區(qū)內選擇了26個具有代表性的樣地,每個樣地使用手持全球定位系統(tǒng)(Global position system,GPS)測定經度、緯度和海拔,隨機設置3個10 m×10 m的樣方,樣方相隔200 m左右,在每個樣方中選擇三株長勢相近的沙冬青,采集其根際土壤,混合,共取得78份土壤樣品。取樣步驟：用鐵鍬去除沙冬青根部周圍枯落物和土壤,在距離地表0—30 cm的地方,待根部露出后收集附著在根表面5 mm以內的土壤置于無菌的50 mL離心管中,將同一樣方中的3株沙冬青根際土壤混勻,編號后置于液氮罐中立即帶回實驗室,部分用于高通量測序,部分自然風干、過篩,用于土壤理化性質的測定。

2.2.2土壤理化性質

土壤理化性質的測定均按照《土壤農化分析》[20]進行測定：土壤pH的測定采用電位測定法(水土比為5∶1)；土壤全氮用全自動凱氏定氮儀測定；土壤全磷和速效磷用流速分析儀測定；有機質用重鉻酸鉀氧化—外加熱法測定；堿解氮用堿解擴散法測定。

2.2.3氣候數(shù)據(jù)

氣候數(shù)據(jù)來自世界氣候數(shù)據(jù)網站(http://www.woridclim.org/),該庫提供了全球1 km×1 km分辨率近50年的月平均氣溫和降水數(shù)據(jù)[21]。氣候數(shù)據(jù)包括年均降雨量、年均溫、太陽輻射。

2.2.4土壤微生物總DNA的提取、PCR擴增及測序

將采集的土壤樣品送到北京百邁客生物科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。使用Mobio土壤強力提取試劑盒(PowerSoil? DNA Isolation Kit)操作步驟提取樣品細菌

16S rRNA基因。對細菌16S rRNA基因(V3+V4)區(qū)域引物[22]：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′進行PCR擴增。PCR反應體系：基因組DNA40—60 ng/5 uL,*Vn F(10 μmol/L) 1.5 μL,*Vn R(10 μM) 1.5 μL,KOD FX Neo(TOYOBO) 1 μL,KOD FX Neo Buf(2X) 25 μL,2dNTP 10 μL,ddH2O補至總體系50 μL。PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 15 min,50℃ 1 min,72℃ 1 min,15個循環(huán)；72℃ 7 min。擴增結果進行1.8%的瓊脂糖凝膠,120 V 40 min電泳后,切目的片段,并回收。PCR擴增后并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫,建好的文庫先進行文庫質檢,質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行雙向測序。對原始數(shù)據(jù)使用FLASH軟件進行拼接,將拼接得到的序列使用Trimmomatic軟件進行質量過濾,并使用UCHIME軟件去除嵌合體,得到高質量的Tags序列(有效序列數(shù))[23]；在相似性97%的水平上使用USEARCH軟件對序列進行聚類,以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs),對OTUs代表序列進行物種注釋,細菌OTUs的序列用RDP Classifier的方法與Silva的數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)進行物種注釋分析(設定置信度閾值為0.8)[24],最后對各樣品的全部數(shù)據(jù)進行均一化處理。

2.2.5數(shù)據(jù)處理

使用SPSS18.0軟件對均值、標準誤進行計算,采用Pearson相關系數(shù)對各個指標進行了相關性分析。采用CANOCO 5.0進行蒙特卡羅檢驗和冗余分析(Redundancy analysis,RDA)分析了生態(tài)因子對細菌多樣性的影響。

3 結果與分析

3.1 蒙古沙冬青根際土壤細菌群落組成分析

通過對沙冬青26個樣地78個樣本高通量測序共檢測到細菌15門、43綱、68目、123科和185屬。圖2和圖3分別展示了沙冬青各樣地門(Phylum)和綱(Class)分類水平的細菌群落結構。從圖2可知,沙冬青根際土壤中檢測到的主要門有：藍菌門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、軟壁菌門(Tenericutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體菌門(Saccharibacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)。藍菌門、變形桿菌門、放線菌門(相對豐度>2%)是土壤中占主導地位的微生物,約占到了所有微生物總數(shù)的70%—80%以上。藍菌門的變化范圍為28.90%—74.62%,均值為65.74%；變形桿菌門的變化范圍為28.90%—40.26%,均值為21.72%；放線菌門的變化范圍為2.38%—14.95%,均值為6.28%。各優(yōu)勢菌門在不同樣地的分布均有明顯差異,大多數(shù)物種已分類明確,樣地中僅有少量未分類命名物種。

圖2 蒙古沙冬青土壤樣品主要細菌種類在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of major bacterial species in the soil samples of A. mongolicus

通過綱分類層次(圖3) 的統(tǒng)計表明：樣品中優(yōu)勢菌綱(相對豐度>2%)主要有α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)。Α-變形菌綱的變化范圍為10.96%—28.36%,均值為17.48%；放線菌綱的變化范圍為1.65%—10.21%,均值為4.76%；γ-變形菌綱的變化范圍為0.70%—7.18%,均值為3.28%。樣品中分類層次不明確和未分類命名的物種較少,說明大多數(shù)已分類明確。在菌綱水平上,已分類清晰和準確命名的細菌群落在不同樣地的分布差異不明顯。

圖3 蒙古沙冬青土壤樣品主要細菌種類在綱水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of major bacterial species in the soil samples of A. mongolicus

3.2 蒙古沙冬青根際土壤細菌多樣性分析

對78個樣品在97%的相似水平下進行高通量測序,共得到有效序列條數(shù)為5539824,對有效序列條數(shù)進行聚類共獲得OTU樣品數(shù)為30671,各樣本OTU覆蓋率(Coverage)均高于99.89%,該指數(shù)反映本次測序結果代表了樣本中微生物的真實情況(表2)。從稀釋曲線的結果(圖4)可以看出,細菌的稀釋曲線隨著測序條數(shù)的加大均基本趨于平緩,則表明樣品序列充分,能夠代表物種的多樣性,可以進行多樣性數(shù)據(jù)分析。

圖4 蒙古沙冬青根際土壤樣本細菌多樣性稀釋曲線Fig.4 Rarefaction curve of bacterial diversity in rhizosphere soil of A. mongolicus

表2所示為蒙古沙冬青根際細菌多樣性指數(shù)。Alpha多樣性反映的是單個樣品物種多樣性,有多種衡量指標：Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)衡量土壤真菌群落物種數(shù)量的多少,指數(shù)越高說明樣品細菌物種數(shù)量就越高,Shannon和Simpson指數(shù)反映土壤細菌群落物種多樣性,Shannon指數(shù)值越大,Simpson指數(shù)值越小,說明樣品的物種多樣性越高。由表2可知,15個采樣點的土壤樣品Ace和Chao1 指數(shù)的變化范圍分別為311.92—511.55、333.87—513.31；Shannon多樣性指數(shù)變化范圍在1.53—4.31之間,其數(shù)值相對較低,說明26個采樣點的細菌多樣性相對較低。

表2 蒙古沙冬青根際土壤細菌多樣性一覽表Table 2 The index of bacterial diversity in rhizosphere soil of A. mongolicus

3.3 蒙古沙冬青根際土壤細菌在門水平上與生態(tài)因子相關性分析

土壤細菌在門平上與水熱及土壤理化因子Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)(表3),大多數(shù)細菌在門水平上的豐度與緯度、海拔、年均降雨量、太陽輻射有顯著相關性,如藍細菌門與緯度極顯著正相關,與年均降雨量極顯著負相關,與太陽輻射顯著正相關；變形桿菌門與緯度和年均降雨量顯著負相關；放線菌門與海拔顯著正相關；酸桿菌門與海拔顯著正相關,與年均降雨量極顯著正相關,與太陽輻射極顯著負相關；擬桿菌門與緯度顯著負相關,與年均降雨量極顯著正相關；螺旋體菌門與緯度極顯著負相關,與年均降雨量極顯著正相關,與太陽輻射顯著負相關；綠彎菌門與海拔極顯著正相關,與年均降雨量顯著正相關；疣微菌門與年均降雨量顯著正相關。其中部分菌門與土壤理化性質有顯著相關性。如放線菌門與降解氮顯著正相關；擬桿菌門與含水率顯著相關；厚壁菌門與全氮極顯著正相關；綠彎菌門與降解氮顯著正相關。

表3 蒙古沙冬青根際土壤細菌在門水平上與環(huán)境因子Pearson相關性分析Table 3 Correlation analysis of rhizosphere soil bacteria in A. mongolicus at the phylum level and environmental factors Pearson

3.4 生態(tài)因子對沙冬青根際土壤細菌多樣性指數(shù)的影響

通過蒙特卡羅檢驗對沙冬青細菌多樣性指數(shù)與環(huán)境因子進行分析,結果顯示沙冬青根際細菌多樣性指數(shù)與年均降雨量(F=12.8,P=0.002)、緯度(F=5.1,P=0.016)、太陽輻射(F=5,P=0.02)呈顯著相關性,為主要的環(huán)境影響因子。而海拔(F=2.9,P=0.066)、堿解氮(F=2.7,P=0.066)、全氮(F=2.4,P=0.1)、年均溫(F=0.7,P=0.432)、有機碳(F=0.4,P=0.614)、pH(F=0.3,P=0.646)、速磷(F=0.3,P=0.714)、全磷(F=0.3,P=0.672)、經度(F=0.1,P=0.982)對沙冬青根際細菌多樣性的影響不顯著。

沙冬青根際土壤細菌多樣性指數(shù)與主要生態(tài)因子RDA排序表明(表4和圖5)：第一至第四主軸累計解釋了沙冬青根際土壤細菌多樣性指數(shù)52.69%的方差,其中第一主軸和第二主軸解釋了沙冬青根際土壤細菌多樣性指數(shù)45.41%和7.16%的方差。因此,沙冬青根際土壤細菌多樣性指數(shù)在排序軸上的分布能夠反映了細菌空間分布特征隨生態(tài)因子的變化趨勢。

表4 蒙古沙冬青根際土壤細菌多樣性指數(shù)與生態(tài)因子RDA排序Table 4 Bacterial diversity index and ecological factors RDA ranking in rhizosphere soil of A. mongolicus

RDA排序圖反映了沙冬青根際細菌群落組成及多樣性與生態(tài)因子之間的關系(圖5)。箭頭越長表示對沙冬青根際細菌群落多樣性的解釋量越大。箭頭的之間的角度代表了變量之間的相關性。角度越小,相關性越大,反之則越小。其結果與相關性分析一致。

圖5 蒙古沙冬青根際土壤細菌多樣性與生態(tài)因子的RDA排序圖Fig.5 RDA ranking of bacterial diversity and ecological factors in rhizosphere soil of A. mongolicusLON：緯度Latitude；LAT：經度Longitude；ALT：海拔Altitude；TP：全磷Total phosphorus；TN：全氮Total nitrogen；SOC：土壤有機質Soil organic matter；AP：速效磷Available phosphorus；AN：堿解氮Alkali-hydrolyzable nitrogen；pH：土壤pH值Soil pH；MAP：年均降雨量Average annual rainfall；MAT：年均溫Annual average temperature；SRAD：太陽輻射Sun radiation

RDA分析表明,沙冬青根際細菌群落多樣性與年均溫、海拔、堿解氮存在正相關關系,與太陽輻射、緯度存在負相關關系,年均溫、太陽輻射和緯度對沙冬青根際細菌群落多樣性的影響較大。緯度和太陽輻射是影響藍細菌門分布的主要因子；堿解氮是影響放線菌門分布的主要因子,年均溫是影響酸桿菌門、擬桿菌門、螺旋體菌門、綠彎菌門、疣微菌門分布的主要因子,全氮是影響厚壁菌門分布的主要因子。生態(tài)因子的相關性,如有機質與堿解氮和全氮正相關,能夠反映出不同樣地土壤中的碳氮耦合對細菌多樣性的影響。

4 討論

4.1 蒙古沙冬青根際土壤細菌群落組成

大多數(shù)根際細菌對植物的生長是有利的,可以給植物提供營養(yǎng),增強植物對營養(yǎng)元素的吸收,還可以保護植物免受病原菌的侵害[25- 26]。隨著高通量測序技術在荒漠生態(tài)系統(tǒng)領域的廣泛應用,對荒漠植物土壤細菌

群落結構的分布特點已有了基本的認識：荒漠植物根系土壤中主要的細菌群落組成基本相似,主要以變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門等為優(yōu)勢菌類[27- 29],這與本研究結果基本一致。沙冬青主要優(yōu)勢菌類為藍細菌門、變形桿菌門、放線菌門,相對豐度和占總豐度的93.73%。藍細菌門相對豐度與年均降雨量呈極顯著負相關(P<0.01),有研究表明,藍細菌是一種古老的自養(yǎng)型細菌,分布很廣泛,種類繁多,有些種類在暗環(huán)境下也能生長,有些種類卻可以利用光能固定碳,氮能力,營養(yǎng)要求極低,而且表現(xiàn)出一定的抗旱抗鹽特性[32],對極端環(huán)境的適應性很強[30-31]。在荒漠貧瘠的土壤中,藍細菌門作為沙冬青根際土壤細菌的第一大類群,能夠為沙冬青富集生長必需元素提供更適宜生長的微環(huán)境,促進沙冬青的生長。變形菌門是一大類細菌群落,能夠降解許多復雜的纖維素[33]與木質素[34],在很多細菌群落研究中都具有最高的相對豐度[35,30]。本研究中變形菌門相對豐度與年均降雨量呈極顯著負相關(P<0.01),有研究發(fā)現(xiàn)放線菌門在土壤含水量較低的土壤中相對含量高[29],與本研究結果一致。在變形菌門中,α-變形菌和γ-變形菌是最重要的亞門,相對豐度范圍分別為10.96%—28.36%、1.32%—7.18%。李新等[36]研究發(fā)現(xiàn)變形菌門是鹽堿土壤的主要類群。本研究中,變形菌門是主要的次優(yōu)勢菌門,而該地區(qū)土壤呈弱堿性與李新等研究結果一致。放線菌門喜歡微堿性土壤,是干旱半干旱土壤中分布比較廣泛的細菌類群,其相對豐度為6.28%。放線菌分枝狀的菌絲體能夠產生各種胞外水解酶,降解土壤中各種不溶性有機物質以供細胞代謝所需的各種營養(yǎng),在自然界物質循環(huán)、土壤改良等方面都具有重要作用[17]。放線菌門是好氣性微生物,土樣含氧量較高的環(huán)境更適合放線菌門的生長[37]。其他菌門雖然在沙冬青根際土壤中都有分布,但相對豐度都比較低。許多研究發(fā)現(xiàn)pH是影響微生物群落的主要影響因素[38],這與本研究的結果不一致,可能是沙冬青分布區(qū)的pH變化范圍比較小,所以對微生物群落的影響比較小。

4.2 蒙古沙冬青根際土壤細菌群落多樣性與生態(tài)因子關系

在野外調查時發(fā)現(xiàn),蒙古沙冬青多生長在沙丘、河灘沙地、砂礫土上,蒙古沙冬青分布地區(qū)根系表層累積了大量的凋落物,土壤微生物通過分解植物根系分泌物及凋落物對土壤理化性質與其自身多樣性產生影響[39]。

一般認為,荒漠地區(qū)土壤微生物群落的組成和功能直接取決于生態(tài)因子[6],例如水分、土壤養(yǎng)分、太陽輻射、植被類型等。沙冬青群落生長于沙地生境,在長期干旱、風蝕條件下,不利于碳和氮積累,導致表層土壤養(yǎng)分貧瘠化,灌木的“肥島”效應不明顯,為其他荒漠植物種的入侵設置了障礙,沙冬青成了該生長區(qū)的灌木優(yōu)勢種[40]。pH、有機質含量、全氮、堿解氮、全磷、速磷[41]等土壤理化因子和經緯度、海拔、年均溫、年均降雨量、太陽輻射等生態(tài)因子可能都影響沙冬青根際土壤細菌的空間分布格局。RDA分析表明：土壤理化因子和pH等對土壤細菌群落結構和多樣性的影響并不顯著,而緯度、年均降雨量、輻射對土壤細菌群落結構和多樣性有顯著性影響,這與賀學禮[18]有關沙冬青根際土壤微生物分布和土壤因子之間有顯著相關性的結果有所不同。究其原因可能是選擇的沙冬青都是野生的,不是人工種植的,人為的擾動很少,沒有土壤營養(yǎng)元素的人為輸入；另外,采樣地緯度和海拔差異較大,具有明顯的尺度效應,這些因素的共同作用,導致土壤營養(yǎng)元素對土壤細菌群落結構和多樣性的影響不如氣候因子影響顯著。許多研究表明,水分對荒漠植物根際微生物多樣性和生長影響較大。本研究中,年均降雨量即水分是影響沙冬青根際土壤細菌群落結構和多樣性的最重要因子,這與前人研究的結果一致[42- 43]。沙冬青根際土壤細菌多樣性與太陽輻射呈負相關,是因為荒漠生境中植物稀疏,地表裸露較多,太陽輻射量對光合微生物來說已遠遠超過其光合有效輻射[44],高強度太陽輻射降低了土壤微生物的存活率和多樣性。

高通量測序技術作為二代測序方法,被大多數(shù)學者用來研究土壤微生物的生物地理學分布[38,45],探究土壤微生物是否像動物、植物那樣隨著緯度的差異而變化。Liu對東北黑土細菌群落的研究認為緯度是影響土壤微生物分布的重要因素[46],Zhang等對不同植被類型下北麓河多年凍土微生物的研究認為緯度不是影響土壤微生物的主要因素[47]。本研究中研究區(qū)域南北跨度比較大,緯度變化明顯,因此緯度變化是影響沙冬青根際土壤細菌分布的主要因素。本研究探明了沙冬青土壤細菌的地理分布,為評估沙冬青在荒漠生態(tài)系統(tǒng)維持中的作用提供理論依據(jù)。

5 結論

(1)在97%的相似度水平下將有效序列進行聚類,獲得的OTU進行分類學物種注釋,26個樣品獲得細菌30671個OTU,蒙古沙冬青檢測到細菌15門,43綱,68目,123科,185屬。

(2)蒙古沙冬青根際土壤中的優(yōu)勢菌門為藍菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)。主要的優(yōu)勢菌綱為主要有α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)。

(3)78個樣本測序覆蓋率均高于99%,Alpha多樣性指數(shù)的測序結果代表了沙冬青根際土壤細菌的真實情況,但細菌多樣性相對較低。

(4)RDA分析顯示：年均降雨量、緯度和太陽輻射是影響沙冬青根際細菌多樣性的主要因子。