孫太福,王 靜,蔡永華,程建國(guó),黎 勇,周 密,盛 巖,孟秀祥,*

1 中國(guó)人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100872 2 四川養(yǎng)麝研究所, 都江堰 611830 3 四川逢春麝業(yè)集團(tuán)有限公司, 成都 610031

麝類動(dòng)物(Moschusspp.)是珍稀資源動(dòng)物,其雄麝麝香囊分泌的麝香被廣泛應(yīng)用于包含我國(guó)中醫(yī)藥在內(nèi)的亞洲傳統(tǒng)醫(yī)藥和香水業(yè)[1- 3]。目前,麝類動(dòng)物已極度瀕危,馴養(yǎng)成為瀕危麝類遷地保育及藥用麝香可持續(xù)供給的有效措施。長(zhǎng)期以來(lái),諸多學(xué)者對(duì)林麝等麝類動(dòng)物的種群動(dòng)態(tài)和年齡結(jié)構(gòu)[4- 6]、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)[7- 8]、圈舍環(huán)境[4]、泌香期行為[7, 9]、泌香生理[10- 12]、動(dòng)物個(gè)性[13]和行為多樣性[14]等因素與麝香分泌的關(guān)系開(kāi)展了系統(tǒng)研究,但麝香分泌與激素水平關(guān)系的研究相對(duì)較少。

激素是影響動(dòng)物個(gè)體生理和行為的關(guān)鍵因素[15], 其中皮質(zhì)醇(Cortisol,COR)和睪酮(Testosterone,T)的分泌受下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)系統(tǒng)軸調(diào)控,與動(dòng)物個(gè)體的應(yīng)激反應(yīng)和繁殖直接關(guān)聯(lián)[15- 16]。汪建隆和黃新民[11]通過(guò)切除睪丸和附睪證明了睪酮與麝香分泌之間關(guān)系緊密,洪沂生等[17]利用雄性激素誘導(dǎo)產(chǎn)生泌香反應(yīng),尹淑媛和戴衛(wèi)國(guó)[10]采用外源睪酮注射誘導(dǎo)雄麝進(jìn)行了二次泌香實(shí)驗(yàn),張爭(zhēng)明等[12]探索了林麝泌香期和發(fā)情期血清性激素含量的變化。上述研究確定了雄麝的睪酮與麝香分泌間存在直接關(guān)聯(lián),但因條件限制,上述研究樣本量往往較小,且多通過(guò)外源激素誘導(dǎo)進(jìn)行,缺乏對(duì)睪酮和麝香分泌直接關(guān)系的基于大樣本的研究。此外,因皮質(zhì)醇與動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的緊密關(guān)系,可對(duì)雄麝的麝香分泌產(chǎn)生潛在效應(yīng),但相關(guān)研究迄今缺乏。

本研究采用非損傷取樣(Noninvasive sampling methods)和放射免疫法(Radio immunoassay, RIA),通過(guò)檢測(cè)圈養(yǎng)林麝糞樣類固醇激素水平,結(jié)合麝香分泌數(shù)據(jù)采集,探查林麝糞樣睪酮和皮質(zhì)醇水平與麝香分泌的關(guān)系,并建立預(yù)測(cè)模型,研究結(jié)果可對(duì)麝類遷地保育及麝香的可持續(xù)生產(chǎn)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究于2018年9月1日—10月15日期間在四川馬爾康林麝繁育場(chǎng)(以下簡(jiǎn)稱馬爾康麝場(chǎng)) (101°17′—102°41′E,30°35′—32°24′N(xiāo)) 進(jìn)行。馬爾康麝場(chǎng)位于四川西部的阿壩州,地處高原,空氣稀薄,輻射強(qiáng)烈,年日照時(shí)數(shù)2214 h,日照率50%,氣候高寒,年均溫為5—9℃,晝夜溫差大,年均降雨760 mm。

本研究涉及樣本36頭,均為雄性個(gè)體,其中亞成體18頭(1.5—2.5歲),成體18頭(3.5—8.5歲)[18]。所有個(gè)體均為單圈飼養(yǎng),圈舍(約10 m2)由一活動(dòng)場(chǎng)和水泥涼棚組成。每日2次于相對(duì)固定時(shí)間(夏季：06:00和19:00；冬季：08:00和17:00)投喂樹(shù)葉及水,附帶進(jìn)行圈舍清潔,其他時(shí)間林麝不受干擾。

1.2 研究方法

1.2.1非損傷糞樣及麝香分泌數(shù)據(jù)采集

在類固醇激素的測(cè)定中,血液是一種應(yīng)用最廣泛測(cè)定樣本[19]。但麝類動(dòng)物生性機(jī)警,對(duì)其采血易導(dǎo)致個(gè)體皮質(zhì)醇等激素的濃度變化[20- 21],并易引發(fā)林麝的應(yīng)激傷亡。非損傷性的糞樣采集可避免動(dòng)物應(yīng)激,近年來(lái)得到了廣泛應(yīng)用[22]。通過(guò)激素代謝物間接確定激素水平,與實(shí)際測(cè)量血液中具有生物活性的激素濃度有差異,但二者間具有緊密相關(guān)[23]。本研究通過(guò)采集林麝的新鮮糞樣對(duì)睪酮和皮質(zhì)醇進(jìn)行測(cè)定[24- 27]。糞樣采集在人工取香前的1個(gè)月內(nèi)(2018年9月1日—15日)進(jìn)行,采集的新鮮糞樣裝入樣品袋,置于冰箱內(nèi)保存(-20℃)留待實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

雄麝的麝香分泌數(shù)據(jù)采集于麝場(chǎng)的人工取香(2018年10月10日)進(jìn)行時(shí)。取香時(shí),進(jìn)行雄麝的快速保定,用藥匙探入其麝香囊將麝香快速取出,吸水紙吸去麝香表面水分后立刻進(jìn)行麝香稱重,記錄麝香品相及泌香量數(shù)據(jù)。每頭麝的取香處理在5 min以內(nèi)。

1.2.2糞樣類固醇激素檢測(cè)

糞樣激素提取采用乙醇為基礎(chǔ)的程序[23, 28],步驟如下：進(jìn)行新鮮糞樣稱重、干燥、研磨,取研磨均勻的糞樣0.5 g,加入90%的乙醇10 mL,并用渦旋振蕩儀震動(dòng)1 min,然后恒溫水浴(60℃)20 min,經(jīng)2000 rmp離心15 min,取上清液；沉淀物中再加入90%的乙醇5 mL,再次震蕩、離心、取上清液。最后,將兩次上清液合并,蒸干后加40%的甲醇1.5 mL,搖勻后放置在-20℃冰箱待測(cè)。

參照其他野生動(dòng)物糞樣激素測(cè)定方法[24, 26],本研究的糞樣類固醇激素檢測(cè)通過(guò)放射免疫法進(jìn)行。采用西安核儀廠xh6080放免儀,試劑盒為北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。運(yùn)用碘[125I]皮質(zhì)醇放射免疫分析藥盒(Iodine [125I] Cortisol Radioimmunoassay Kit)測(cè)定皮質(zhì)醇,其測(cè)試范圍為10—500 ng/mL,靈敏度<2 ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)CV<10%,批間變異系數(shù)CV<15%。運(yùn)用碘[125I]睪酮放射免疫分析藥盒(Iodine [125I] Testosterone Radioimmunoassay Kit)測(cè)定睪酮,測(cè)定范圍為0.1—20 ng/mL,靈敏度<0.02 ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)CV<10%,批間變異系數(shù)CV<15%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究采用Shapiro-Wilk test檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布,采用Pearson相關(guān)分析探查類固醇激素與泌香量間的關(guān)系,否則采用Spearman相關(guān)分析；對(duì)類固醇和泌香量間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析(Enter Regression Analysis)。

按照個(gè)體的平均麝香分泌量,將個(gè)體區(qū)分為高泌香量雄麝(高于均值)和低泌香量雄麝(低于均值)；按照個(gè)體的平均睪酮水平,將個(gè)體區(qū)分為睪酮較高個(gè)體(高于均值)及睪酮較低個(gè)體(低于均值)；按照個(gè)體的平均皮質(zhì)醇水平,將個(gè)體區(qū)分為皮質(zhì)醇較高個(gè)體(高于均值)及皮質(zhì)醇較低個(gè)體(低于均值)。采用t檢驗(yàn)檢測(cè)亞成體和成體間的泌香量及類固醇激素水平差異；采用一般線性模型(General Linear Model, GLM)探究睪酮、皮質(zhì)醇和年齡對(duì)泌香的綜合效應(yīng)及變量間的潛在交互作用。本研究顯著性水平設(shè)為P=0.05,極顯著為P=0.01,所有數(shù)據(jù)分析均在SPSS 20中進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 圈養(yǎng)林麝糞樣類固醇激素水平及泌香量分布格局

馬爾康麝場(chǎng)圈養(yǎng)林麝雄體的泌香量(P=0.404)和糞樣皮質(zhì)醇濃度(P=0.928)均呈正態(tài)分布,糞樣睪酮濃度呈非正態(tài)分布(P=0.000),經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的睪酮數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布(P=0.687)。馬爾康麝場(chǎng)圈養(yǎng)雄性林麝的睪酮和皮質(zhì)醇濃度均值分別為(106.03±12.34) ng/g (n=36)和(47.49±1.53) ng/g (n=36),泌香量均值為(12.53±0.76) g (n=36)。

2.2 圈養(yǎng)林麝糞樣類固醇激素、泌香量與年齡的關(guān)系

馬爾康麝場(chǎng)圈養(yǎng)雄麝亞成體泌香量(13.14±1.10) g (n=18)有高于成體泌香量(11.93±1.06) g (n=18)的趨勢(shì),但差異不顯著(t=0.793,df=34,P=0.433)；亞成體糞樣睪酮水平(112.28±18.85) ng/g (n=18)與成體(99.78±16.36) ng/g (n=18)間無(wú)顯著差異(t=0.259,df=34,P=0.797)；亞成體糞樣皮質(zhì)醇水平(47.91±2.07) ng/g (n=18)與成體(47.09±2.38) ng/g (n=18)間的差異也不顯著(t=0.501,df=34,P=0.620)(圖1)。

圖1 圈養(yǎng)林麝泌香量、睪酮和皮質(zhì)醇在亞成體與成體間的差異Fig.1 The difference of musk secretion, testosterone and cortisol between sub-adult and adult in captive forest musk deer

2.3 糞樣類固醇激素與麝香分泌的關(guān)系

圈養(yǎng)林麝睪酮濃度與泌香量呈顯著正相關(guān) (r=0.436,P=0.008),泌香較多雄麝(16.50±0.61) g (n=17)的糞樣睪酮濃度(141.51±21.86) ng/g (n=17)極顯著地高于泌香較少雄麝(8.98±0.59) g (n=19)的糞樣睪酮濃度(74.27±7.93) ng/g (n=190)(t=-3.252,df=34,P=0.003)。方程y=0.021x+10.270(R2=0.120,F1, 34=4.639,P=0.038)可較好地?cái)M合二者間關(guān)系(圖2)。

皮質(zhì)醇與泌香量間的相關(guān)不顯著(r=0.078,P=0.652)。泌香較多雄麝的糞樣皮質(zhì)醇濃度(48.98±2.28) ng/g (n=17)略高于泌香較少雄麝的糞樣皮質(zhì)醇濃度(46.17±2.14) ng/g (n=19),差異未達(dá)顯著(t=-0.901,df=34,P=0.374)。方程y=0.038x+10.730(R2=0.023,F1, 34=0.207,P=0.652)可近似擬合皮質(zhì)醇與泌香量間的關(guān)系(圖3)。

圖2 圈養(yǎng)林麝雄體糞樣睪酮水平與麝香分泌的關(guān)系 Fig.2 Relationships between the fecal testosterone and musk secretion in captive female forest musk deer

圖3 圈養(yǎng)林麝雄體糞樣皮質(zhì)醇水平與麝香分泌的關(guān)系 Fig.3 Relationships between the fecal cortisol and musk secretion in captive female forest musk deer

一般線性模型(GLM)分析結(jié)果表明,雄麝糞樣睪酮水平對(duì)個(gè)體泌香量有顯著影響(P=0.037),睪酮水平較高林麝泌香量(14.97±1.17) g (n=12)顯著高于睪酮水平較低水平個(gè)體的泌香量(11.32±0.90) g (n=24)(F=4.79,P=0.037),皮質(zhì)醇(F=0.40,P=0.535) 、年齡(F=0.12,P=0.732)及各變量間的交互作用(皮質(zhì)醇×睪酮,F=0.08,P=0.775；皮質(zhì)醇×年齡,F=0.10,P=0.767；睪酮×年齡,F=0.76,P=0.391；皮質(zhì)醇×睪酮×年齡,F=0.84,P=0.367)對(duì)泌香影響均不顯著。此外,睪酮與皮質(zhì)醇之間的相關(guān)未達(dá)顯著水平(r=0.125,P=0.469)。

3 討論

3.1 圈養(yǎng)林麝糞樣類固醇激素水平、泌香量與圈養(yǎng)模式的關(guān)系

本研究采用放射免疫法測(cè)定圈養(yǎng)林麝糞樣激素濃度,睪酮和皮質(zhì)醇濃度均值分別為(106.03±12.34) ng/g和皮質(zhì)醇(47.49±1.53) ng/g,與郎冬梅等[29- 30]測(cè)定的林麝糞樣激素濃度(糞樣睪酮濃度：65.21—78.03 ng/g；糞樣皮質(zhì)醇濃度：136.42—208.16 ng/g)存在一定差異,這主要與麝場(chǎng)位置、麝場(chǎng)飼養(yǎng)管理制度及動(dòng)物的健康度有關(guān)。與陜西鳳縣麝場(chǎng)[29- 30]相比,本研究中的林麝糞樣睪酮濃度較高、皮質(zhì)醇水平較低,反映了本研究實(shí)施的四川馬爾康麝場(chǎng)圈養(yǎng)林麝的繁殖狀況相對(duì)良好、脅迫及應(yīng)激水平相對(duì)較低。

郭妍妍等[4]報(bào)道四川馬爾康麝場(chǎng)雄麝的泌香量區(qū)間為0—19.60 g,均值為(9.24±0.77) g,程建國(guó)等[7]曾報(bào)道馬爾康麝場(chǎng)雄麝泌香量平均為(11.85±0.96) g,上述研究的林麝均為群養(yǎng)模式。本研究中的雄麝均為單圈飼養(yǎng),個(gè)體泌香量均值為(12.53±0.76) g,說(shuō)明單圈飼養(yǎng)雄麝更利于提高麝香分泌,原因與麝類動(dòng)物較強(qiáng)的獨(dú)居性和警覺(jué)性有關(guān)[31]。此外,有研究顯示,麝類動(dòng)物的單圈飼養(yǎng)可有效減少個(gè)體間的打斗能耗及傷亡,增加麝的存活率[32]。因此,除氣候、植被及食物等因素可影響圈養(yǎng)麝的麝香分泌之外,圈養(yǎng)和飼養(yǎng)模式對(duì)其泌香也有顯著影響。

3.2 圈養(yǎng)林麝糞樣類固醇激素水平與泌香量的關(guān)系

睪酮是一種19碳甾體激素,主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌,少量來(lái)自腎上腺皮質(zhì),其主要生理作用是維持雄性第二性征和正常性腺功能,除具有雄性激素的作用外,還可促進(jìn)蛋白合成[33]。汪建隆和黃新民[11]的工作表明,當(dāng)切除正常泌香雄麝的睪丸和附睪后,雄麝停止泌香,而給予外源睪酮及腦垂體促性腺激素刺激之后,雄麝又重啟泌香生理過(guò)程。此外,睪酮誘導(dǎo)可使雄麝展現(xiàn)自然泌香之外的額外泌香反應(yīng)[10, 17]。上述研究說(shuō)明雄麝的睪酮與麝香分泌之間具有直接關(guān)聯(lián)[12, 34]。研究結(jié)果顯示,圈養(yǎng)林麝睪酮濃度與泌香量呈顯著正相關(guān),泌香較多雄麝的睪酮濃度極顯著地高于泌香較少雄麝,而睪酮水平較高林麝的泌香量也顯著高于睪酮水平較低雄麝的泌香量,說(shuō)明雄麝雄性激素里的睪酮可影響其麝香分泌,這為麝類馴養(yǎng)產(chǎn)業(yè)中的麝香生產(chǎn)力水平提高提供了重要參考。

睪酮作為一種雄性激素,在有蹄類動(dòng)物中對(duì)雄性的繁殖行為發(fā)揮著重要作用,如麋鹿(Elaphurusdavidianus)的繁殖行為發(fā)生頻次與睪酮水平具有顯著的正相關(guān)[27],馬鹿(Cervuselaphus)及馴鹿(Rangifertarandus)睪酮水平的季節(jié)性變化會(huì)導(dǎo)致繁殖交配行為及攻擊行為的強(qiáng)度發(fā)生變化[35- 36]。張爭(zhēng)明等[12]發(fā)現(xiàn),外源睪酮可誘導(dǎo)林麝雄體進(jìn)入發(fā)情期?？紤]到麝類動(dòng)物雄體繁殖與麝香分泌的潛在關(guān)系[2],未來(lái)有必要進(jìn)行睪酮水平與麝香分泌、繁殖成效和節(jié)律關(guān)系的探究。

研究結(jié)果表明,雖不同皮質(zhì)醇水平的雄麝在泌香量方面存在一定差異,但雄麝皮質(zhì)醇濃度與其泌香量無(wú)顯著相關(guān)。皮質(zhì)醇是一種主要由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的糖皮質(zhì)激素,其主要功能與應(yīng)激和壓力有關(guān),與動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境變化有關(guān)。當(dāng)皮質(zhì)醇濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí),都不利于正常生理過(guò)程與行為反應(yīng)[37]。當(dāng)皮質(zhì)醇濃度過(guò)低時(shí),個(gè)體無(wú)法正常進(jìn)行應(yīng)激,當(dāng)皮質(zhì)醇過(guò)高時(shí),會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂,血糖、血壓升高等。因此,適量的皮質(zhì)醇水平有利于維持機(jī)體的正常代謝,尤其是應(yīng)對(duì)外源性壓力。有研究表明皮質(zhì)醇濃度會(huì)影響獵豹的繁殖性能[38]?？紤]睪酮對(duì)泌香的效應(yīng)、皮質(zhì)醇和睪酮間的關(guān)系及皮質(zhì)醇對(duì)個(gè)體脅迫狀態(tài)的調(diào)節(jié),可進(jìn)一步對(duì)麝的皮質(zhì)醇、睪酮及泌香量間的關(guān)系開(kāi)展長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè),有望揭示之間的復(fù)雜關(guān)系。

諸多研究報(bào)道的圈養(yǎng)林麝的泌香高峰期不等,為4—7歲[4]、2—8歲[7]、2—6歲[32]等,圈養(yǎng)馬麝和原麝的泌香高峰期也在7—9歲之前[5- 6],其中1.5歲齡馬麝的平均泌香量最大[5],康發(fā)功等[5]的工作表明,圈養(yǎng)馬麝的圈養(yǎng)年限、年齡及受脅迫程度間存在關(guān)聯(lián),導(dǎo)致雄性馬麝年齡與麝香分泌量間的非線性關(guān)系?？梢?jiàn),圈養(yǎng)麝的雄體年齡與其泌香量具有關(guān)聯(lián),但因麝種、麝場(chǎng)位置及飼養(yǎng)管理制度的不同而異。本研究中,亞成體雄麝的泌香量高于成體雄麝的泌香量,與本結(jié)果類似,郭妍妍等[4]的研究表明,馬爾康麝場(chǎng)林麝隨年齡增長(zhǎng),其泌香量有減少的趨勢(shì),推測(cè)與成麝的發(fā)情交配等有關(guān)。

3.3 建議

研究結(jié)果顯示圈養(yǎng)林麝雄體的糞樣睪酮濃度與泌香量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系,且睪酮水平較高林麝的泌香量顯著高于低水平個(gè)體的泌香量,在麝類馴養(yǎng)及麝香生產(chǎn)實(shí)踐中,可將糞樣睪酮水平作為林麝泌香量的預(yù)測(cè)變量,應(yīng)用于麝的分類馴養(yǎng)及高泌香量圈養(yǎng)麝品系的選育,商業(yè)性麝類馴養(yǎng)中可應(yīng)用外源睪酮誘導(dǎo)圈養(yǎng)雄麝的多次泌香、泌香量增加及無(wú)香個(gè)體的麝香分泌重啟。