楊曉輝,賈曉強(qiáng)

(天津大學(xué) 化工學(xué)院 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300354)

脂肪酸是由烴鏈和羧基組成的有機(jī)化合物，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)是其中的一類[1]。多不飽和脂肪酸中的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6)在預(yù)防心血管疾病、炎癥、自身免疫性疾病等方面發(fā)揮著重要作用[2]。以往獲取DHA的傳統(tǒng)來(lái)源是深海魚(yú)油[3]，然而，這些來(lái)源的DHA具有魚(yú)腥味重、穩(wěn)定性差的問(wèn)題[4]。研究表明，海洋魚(yú)類中DHA的積累主要來(lái)源于微藻，因此，可以開(kāi)發(fā)利用生產(chǎn)DHA的微藻的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)DHA的微生物生產(chǎn)[5]。

海洋微生物細(xì)胞中含有大量的DHA，且被認(rèn)為是生產(chǎn)這種重要脂肪酸的潛在微生物來(lái)源。異養(yǎng)非光合微藻——寇氏隱甲藻(Cryptheccodiniumcohnii)可積累較高比例的脂質(zhì)(約為細(xì)胞干重的40%)和高質(zhì)量的DHA，近年來(lái)備受關(guān)注[6-8]，且因其產(chǎn)生的脂質(zhì)中，其他多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量相對(duì)于DHA的含量來(lái)說(shuō)非常少，故非常有利于后期DHA的純化。但與許多其他微藻一樣，脂質(zhì)積累效率和生物量是阻礙其工業(yè)化生產(chǎn)的兩個(gè)限制因素[9]。

為了解決這些問(wèn)題，已有多種方法被報(bào)道，包括誘變育種[10]、發(fā)酵條件的優(yōu)化[11-12]，尋找最適氮源等[13-14]。但在這些努力下，隱甲藻的脂質(zhì)產(chǎn)量依舊低于其他的產(chǎn)油微生物[15-16]。與此同時(shí)，利用基因工程方法提高藻類微生物的脂質(zhì)含量及生物量也被廣泛研究，又因?yàn)槿狈θ蚪M序列信息，限制了這種方法的深入應(yīng)用。因此，研發(fā)DHA生產(chǎn)水平較高的工程藻株，探索高產(chǎn)DHA的發(fā)酵技術(shù)具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

1 隱甲藻概況及其DHA的合成途徑

寇氏隱甲藻(C.cohnii)是有鞭毛的異養(yǎng)海生甲藻，形態(tài)多樣，一般為單細(xì)胞。它作為單細(xì)胞真核微生物，既可以進(jìn)行無(wú)性繁殖，也可以進(jìn)行有性繁殖。圖1(a)為Parrow等[17]通過(guò)掃描電鏡得到的隱甲藻電子顯微鏡照片，圖1(b)為本實(shí)驗(yàn)室活化培養(yǎng)的隱甲藻ATCC 30772的普通光學(xué)顯微鏡照片。

圖1 電子顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡下的隱甲藻Fig.1 Crypthecodinium cohnii observed in electron microscope and optical microscope

目前，已發(fā)現(xiàn)的可以生產(chǎn)DHA 的海洋菌大部分是低級(jí)藻狀菌，在這其中研究比較多的有兩種，分別是破囊壺菌和裂殖壺菌[18-19]。具有DHA生產(chǎn)能力的微藻種類繁多且常見(jiàn)的是甲藻，如C.cohnii?？苁想[甲藻有較高的DHA生產(chǎn)能力，見(jiàn)表1，且在其產(chǎn)生的脂質(zhì)中，其他多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量相對(duì)DHA的含量來(lái)說(shuō)非常少，含量低于 1%，這非常有利于后期的DHA純化。由于人們對(duì)醫(yī)藥或食品原料的要求非常高，而且多不飽和脂肪酸容易被降解或氧化，所以分離與純化的過(guò)程在微生物生產(chǎn) DHA 的過(guò)程中非常關(guān)鍵。C.cohnii因其PUFA含量較少的特點(diǎn)使它成為眾多DHA生產(chǎn)藻中的優(yōu)勢(shì)藻株[20]。

表1 不同微生物中DHA的百分含量的比較Table 1 Comparison of percentages of DHA in the lipids of different microorganisms

隱甲藻中ω-3多不飽和脂肪酸和DHA的總含量超過(guò)了30%，但是，隱甲藻中DHA詳細(xì)的合成途徑目前仍是不明確的。

1.1 FAS途徑

根據(jù)以往研究，人們通常認(rèn)為 DHA 的合成最開(kāi)始是利用長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸作為底物的，然后再在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微粒體中進(jìn)行合成，之后再通過(guò)一系列的碳鏈延伸及去飽和過(guò)程獲得，這種途徑被稱為脂肪酸合成(Fatty Acid Synthesis，F(xiàn)AS)途徑[21]，見(jiàn)圖2[22]。

圖2 脂肪酸合成途徑及碳鏈延伸/去飽和途徑[27]Fig.2 Fatty acid synthesis(FAS)pathway and carbon chain elongation /desaturation pathway

然而對(duì)于通過(guò)該途徑合成DHA的合理性還存在很大爭(zhēng)議，主要問(wèn)題在于Δ4去飽和酶(Δ4 Desaturase，Δ4 Des)是否存在于該途徑中，因?yàn)槿藗冊(cè)谳^長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)很難在DHA的合成過(guò)程中表征Δ4去飽和酶的活性，它的存在只是一個(gè)假設(shè)[23]。Qiu等[24]通過(guò)把破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)中編碼Δ4去飽和酶的兩段cDNA(Fad4和Fad5)在釀酒酵母中表達(dá)，證實(shí)了Δ4去飽和酶參與破囊壺菌中DHA的合成，但是Δ4去飽和酶在寇氏隱甲藻中的作用機(jī)制還未有詳細(xì)報(bào)道。Beach等[25]用14C標(biāo)記的乙酸鹽和辛酸鹽培養(yǎng)隱甲藻時(shí)，在所有的脂肪酸中都可以檢測(cè)到同位素，而當(dāng)用14C標(biāo)記的C10-C18脂肪酸(十八碳一烯酸(18∶1)和二十二碳六烯酸(22∶6)合成的前體物質(zhì))培養(yǎng)隱甲藻時(shí)，只有(18∶1)中檢測(cè)到同位素，而在(22∶6)中沒(méi)有檢測(cè)到。Sonnenborn 和 Kunau[26]則認(rèn)為隱甲藻中的 FAS 途徑為 DHA 的合成提供了前體物質(zhì)。

1.2 PKS途徑

James等[27]在裂殖壺菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了DHA合成的另一條途徑，稱為聚酮合酶合成(Polyketide Synthases，PKS)途徑。迄今為止，已鑒定的所有多不飽和脂肪酸合成酶都是分子結(jié)構(gòu)極大的多功能酶復(fù)合物，由三至四個(gè)亞基組成。每個(gè)亞基可能含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如丙二酰輔酶A：ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)，?；d體蛋白(ACP)，3-酮?；厦?KS)，3-酮脂酰-ACP還原酶(KR)，?；D(zhuǎn)移酶(AT)，鏈長(zhǎng)度因子(CLF)，烯酰還原酶(ER)和3-羥基?；?ACP脫水酶(DH)。結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，位置和順序都決定了從酶復(fù)合物中釋放的最終代謝產(chǎn)物。Fisch等和Liu等進(jìn)行了PKS酶的合理結(jié)構(gòu)域交換，成功改變了其產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)并有效地產(chǎn)生了新的聚酮化合物，見(jiàn)圖3。Ratledge[28]認(rèn)為隱甲藻類似于裂殖壺菌，也利用 PKS 途徑合成 DHA，且是隱甲藻中其他多不飽和脂肪酸產(chǎn)生的唯一途徑。

但是由于目前隱甲藻沒(méi)有完整的基因組信息，利用基因信息使用分子操作對(duì)其進(jìn)行改造實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的研究十分受限。因此目前對(duì)隱甲藻產(chǎn)DHA的研究，大多是通過(guò)外界宏觀培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的改變使DHA產(chǎn)量提高，并利用代謝組學(xué)手段分析引起產(chǎn)量提高的內(nèi)在機(jī)制，繼而通過(guò)理性改造相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)DHA產(chǎn)量的提高。在下一節(jié)的隱甲藻高產(chǎn)DHA的理性設(shè)計(jì)和改造研究中將進(jìn)行相關(guān)敘述。

圖3 聚酮合酶合成途徑Fig.3 Polyketide synthese(PKS)pathway

2 隱甲藻高產(chǎn)DHA的理性優(yōu)化和改造研究

代謝組學(xué)(Metabolomic)的概念早在1999年由Nicholson提出，通過(guò)代謝組學(xué)手段的分析我們可以確定代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，并對(duì)相關(guān)代謝路徑進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)節(jié)。

通過(guò)對(duì)常見(jiàn)的外界宏觀條件的改變，如碳氮源、pH、溫度、溶氧水平和化學(xué)誘導(dǎo)劑；利用代謝組學(xué)分析得到的結(jié)果在分子水平上對(duì)相關(guān)輔酶進(jìn)行調(diào)節(jié)和基因進(jìn)行改造以及發(fā)酵法生產(chǎn)DHA，綜合敘述通過(guò)理性優(yōu)化和改造提高隱甲藻DHA產(chǎn)量的研究進(jìn)展。

2.1 碳氮源、pH和溫度

人們研究發(fā)現(xiàn)，寇氏隱甲藻可以在營(yíng)養(yǎng)豐富的海水中具備非常好的生長(zhǎng)能力，可以達(dá)到很高的生物量。后來(lái)的研究人們又注意到寇氏隱甲藻可以利用的碳源的種類非常多，例如葡萄糖、乙酸和乙醇等[29-30]。研究表明，寇氏隱甲藻對(duì)自身所處的培養(yǎng)環(huán)境非常敏感，且細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸組成更是會(huì)受培養(yǎng)條件的影響而產(chǎn)生明顯變化?？苁想[甲藻生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基中的初始葡萄糖濃度為9 g/L，Li等[31]通過(guò)實(shí)驗(yàn)室馴化得到了一株高葡萄糖濃度耐受的隱甲藻，耐受葡萄糖濃度達(dá)到54 g/L，但馴化株在45 g/L葡萄糖濃度下油脂產(chǎn)量最高。利用加權(quán)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)代謝數(shù)據(jù)分析模型(WGCNA)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，認(rèn)為谷氨酸、甘油、丙二酸和琥珀酸是和馴化株高度相關(guān)的核心化合物。Waseem等研究了不同氮源[(NH4)2SO4,(NH2)2CO,NH4HCO3和NaNO3]及其濃度對(duì)隱甲藻生產(chǎn)DHA的影響。結(jié)果表明，0.8 g/L的NaNO3作氮源能夠獲得較高的DHA產(chǎn)量，且認(rèn)為檸檬酸裂解酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸酶、NADP和NAD+對(duì)N有顯著的響應(yīng)。陳峰等[32]發(fā)現(xiàn)隱甲藻細(xì)胞生長(zhǎng)及DHA積累的最適pH在6.0～7.5 之間；當(dāng)pH低于3.96或高于9.75時(shí)，細(xì)胞基本不發(fā)生生長(zhǎng)，處于被抑制的狀態(tài)。但pH在5.5～8.0之間時(shí)，pH對(duì)菌體生長(zhǎng)與脂質(zhì)的生產(chǎn)影響不大。郭小婧等[33]研究了隱甲藻在15,20,22,25,28 ℃下條件下以搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方式獲得的最大生物產(chǎn)量和最高DHA產(chǎn)量，結(jié)果表明，最適溫度為 22 ℃，由此獲得的生物產(chǎn)量為234.85 mg/(L·d)，DHA產(chǎn)量為17.45 mg/(L·d)，DHA含量為74.36 mg/g 菌體。

2.2 不同溶氧水平和化學(xué)誘導(dǎo)劑

氧的供應(yīng)在隱甲藻生產(chǎn)DHA的發(fā)酵期間是非常重要的外界因素。然而，關(guān)于溶解氧(Dissolved Oxygen,DO)與細(xì)胞代謝之間的內(nèi)在相關(guān)性研究報(bào)道很少。Diao等[34]評(píng)估了隱甲藻對(duì)不同DO水平的反應(yīng)，表明在高供氧條件下，隱甲藻的生長(zhǎng)速率和對(duì)葡萄糖的消耗速率要高得多。此外，基于GC-MS的比較代謝組學(xué)分析用于區(qū)分與不同DO水平相關(guān)的響應(yīng)代謝物的結(jié)果表明，在指數(shù)期高DO水平下，參與糖酵解途徑和TCA循環(huán)的中間代謝物上調(diào)。在穩(wěn)定期，在高DO水平下，涉及三酰基甘油代謝的代謝物被上調(diào)，而OPP途徑的中間產(chǎn)物核糖-5-磷酸被下調(diào)。

Bose等[35]的研究表明，多種化學(xué)分子可用于增強(qiáng)脂質(zhì)的積累，包括來(lái)源于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和胺等的化學(xué)物質(zhì)。為了明確這些化學(xué)誘導(dǎo)劑增強(qiáng)DHA生產(chǎn)的效果和機(jī)制，Li等[36]研究了來(lái)自生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和胺的化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)隱甲藻中脂質(zhì)積累的影響。結(jié)果表明，萘氧基乙酸(BNOA)、2-氯二十二酸、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)和乙醇胺(ETA)使隱甲藻中的脂質(zhì)積累增加了10.00%～18.78%。此外，采用靶向代謝組學(xué)方法來(lái)解釋導(dǎo)致脂質(zhì)積累增加的機(jī)制，結(jié)果表明糖酵解和TCA循環(huán)中的代謝增強(qiáng)以及PPP途徑中代謝減少對(duì)于脂質(zhì)的積累具有重要作用。

2.3 分子水平改造

通常，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)是參與碳固定的第一個(gè)關(guān)鍵步驟的酶，但RuBisCO在非光合作用的隱甲藻中的特定作用尚未明確闡明。然而就細(xì)胞代謝而言，在異養(yǎng)條件下，涉及CO2固定和光呼吸的途徑可能不是必需的。刪除這些高豐度但非必需基因如RuBisCO，可以優(yōu)化碳通量并重定向能量流動(dòng)(ATP和NADPH)。Diao等[37]選擇在自養(yǎng)條件下可能參與CO2固定的RuBisCO作為構(gòu)建突變株的靶標(biāo)。與野生型相比，RuBisCO基因的缺失促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)且在異養(yǎng)條件下增加了隱甲藻中脂質(zhì)的含量?；谝合嗌V-質(zhì)譜(LC-MS)的代謝組學(xué)分析也表明，RuBisCO基因的缺失有助于更多的碳或能量向細(xì)胞生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累流動(dòng)。

2.4 發(fā)酵法生產(chǎn)DHA的研究現(xiàn)狀

1962年，Javornick首次在海邊采集得到寇氏隱甲藻。美國(guó)哥倫比亞的Mertek公司已用該菌種實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)。2003年，Swaaf等[38]用葡萄糖為底物在生物反應(yīng)器中通過(guò)分批補(bǔ)料的發(fā)酵方式培養(yǎng)寇氏隱甲藻ATCC 30772，在培養(yǎng)400 h之后，Swaaf等獲得的最大菌體生物量達(dá)到109 g/L，總脂質(zhì)含量為61 g/L，DHA的含量為19 g/L。

目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)發(fā)酵法進(jìn)行DHA生產(chǎn)的研究主要是集中于藻株誘變和發(fā)酵條件的優(yōu)化等方面。2001年，王菊芳等[39]研究了3種無(wú)機(jī)鹽(NaCl、MgSO4和KH2PO4)對(duì)隱甲藻生長(zhǎng)及DHA產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明隱甲藻可在NaCl為唯一無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，DHA產(chǎn)量達(dá)到499.93 mg/L。2010年，梅志剛等[40]利用響應(yīng)面法優(yōu)化隱甲藻生產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基配方，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基條件下，DHA產(chǎn)量達(dá)0.91 g/L，是優(yōu)化前產(chǎn)量的2.48倍。2012年，孫中貫等[41]利用亞硝基胍對(duì)隱甲藻ATCC 30556進(jìn)行誘變處理，最后得到的突變株的DHA產(chǎn)量達(dá)到1.057 g/L。 任路靜等[42]利用流加策略實(shí)現(xiàn)了隱甲藻生產(chǎn)DHA的高密度發(fā)酵，結(jié)果表明，在葡萄糖濃度為4 g/L左右時(shí)，流加碳氮比為30∶1的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)隱甲藻的生長(zhǎng)和脂肪酸積累最有利，DHA產(chǎn)量達(dá)到4.08 g/L。2015年，王澍等[43]又對(duì)寇氏隱甲藻突變株產(chǎn)DHA的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。優(yōu)化后在50 L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)得到的DHA的產(chǎn)量為5.65 g/L，比優(yōu)化前提高了10.35%。2016年，王澍等[44]又通過(guò)探究不同補(bǔ)糖時(shí)間和不同補(bǔ)糖量對(duì)寇氏隱甲藻突變株產(chǎn)DHA的影響，最后使DHA的產(chǎn)量可達(dá)到11.94 g/L。

3 總結(jié)

近年來(lái)，雖然對(duì)寇氏隱甲藻的改造和發(fā)酵的生產(chǎn)研究投入了大量的精力，但DHA生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)量低、成本高等瓶頸問(wèn)題仍然存在，解決這些問(wèn)題依舊迫在眉睫。除了傳統(tǒng)的學(xué)科知識(shí)和研究手段，合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和CRISPR(規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列)等學(xué)科技術(shù)的興起，使人為控制微生物代謝從而提高目標(biāo)代謝物產(chǎn)量成為現(xiàn)實(shí)。因此，構(gòu)建高產(chǎn)DHA的工程藻株可以在這些學(xué)科的支持下進(jìn)一步開(kāi)展。本文為寇氏隱甲藻的下一步的研究方向作了三點(diǎn)展望：

(1)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究隱甲藻發(fā)酵期間不同生長(zhǎng)階段的代謝狀態(tài)。功能注釋后，鑒定與隱甲藻中脂肪酸和DHA生物合成潛在相關(guān)的基因和途徑。并基于氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)的代謝組學(xué)分析定義細(xì)胞中的小分子多樣性，這種手段有助于更好地了解隱甲藻的整體代謝，可以對(duì)隱甲藻中DHA生物合成的關(guān)鍵基因有深入了解。

(2)關(guān)鍵酶的研究。全面了解DHA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶對(duì)高產(chǎn)DHA的寇氏隱甲藻工程藻株的構(gòu)建具有非常重要的意義，并通過(guò)對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)研究達(dá)到人工構(gòu)建的目的。同時(shí)我們還需要進(jìn)一步研究寇氏隱甲藻生產(chǎn)DHA 途徑中的各種酶活性的變化，從而找到代謝關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為調(diào)整代謝流等工作奠定基礎(chǔ)。

(3)基因組重測(cè)序。首先需要完善寇氏隱甲藻的全基因組信息，由于寇氏隱甲藻是真菌藻類，基因組信息龐大，因此需要長(zhǎng)期仔細(xì)的分析全基因組信息來(lái)構(gòu)建DHA完整的代謝網(wǎng)絡(luò)，然后再利用代謝組學(xué)等手段對(duì)DHA合成的整個(gè)代謝途徑進(jìn)行分析，在確定了DHA在生物合成過(guò)程中的代謝限速步驟和關(guān)鍵控制基因之后，對(duì)與DHA生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行改造、重排或者修改，從而獲得可以高產(chǎn)DHA的人工寇氏隱甲藻工程藻株。