李艷榮，李巖，靳遠，郭蓮怡

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，貴州 遵義 563000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種長期且易反復發(fā)作的慢性炎癥疾病，發(fā)病機制復雜，常認為是遺傳、免疫、腸道微生物等多種因素共同作用，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、膿血便等癥狀。UC的病理表現(xiàn)主要為炎癥和潰瘍，發(fā)病于結腸黏膜及黏膜下層，可累及遠端結腸及全結腸等部位。近年來，UC病發(fā)率不斷增加，可引發(fā)結腸癌，為難治性疾病之一[1]。

炎癥反應，為機體的防御系統(tǒng)，當受到微生物侵襲時，機體可通過炎癥反應做出相應保護。UC患者存在的腸道菌群失調(diào)、感染等因素，可產(chǎn)生內(nèi)毒素，而內(nèi)毒素中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可刺激機體免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應。研究認為Toll樣受休(toll like receptors，TLRs)與炎癥反應密切相關[2]。TLR通過識別LPS，激活MyD88活化，誘導IRAKs磷酸化，進而激活TRAF-6，TRAF-6識別IKK復合體，進而導致NF-kB活化?；罨腘F-kB可促進炎癥因子表達，加劇炎癥反應[3]。TLR9信號通路與腸道炎癥密切相關，可影響腸道粘膜生理功能[4]。

microRNA為非編碼小RNA，可在轉錄水平后抑制靶基因的表達或翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155為一種多功能基因，參與炎癥、免疫等生物反應過程[5]。然而，miR-155是否通過調(diào)控TLR9信號通路影響潰瘍性結腸炎，還需要進一步的研究與闡明。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/C小鼠20只，雄性，5～6 周齡，體重20～22 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司(SCXK(京)2016-0002)。飼養(yǎng)于SPF級動物實驗中心，相對濕度40%～60%，每日光照12 h，所有小鼠自由進食飲水。適應性喂養(yǎng)7 d。

1.2 建立UC模型及分組

采用含3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)飲水的方法建立UC小鼠模型。正常組小鼠10只予正常飲水15 d，UC模型組小鼠10只予含3%DSS飲用水連飲7 d，第8～15天予正常飲用水。

1.3 測定指標及方法

每天觀察小鼠活動、飲水飲食等基本情況，用疾病活動指數(shù)(DAI)評估UC小鼠疾病狀態(tài)(DAI計算方法見表1)；實驗第14天晚上將小鼠禁食8 h，次日取材。眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠，置于冰上，從肛門上截取結腸標本，測量，記錄長度；將結腸置于-80 ℃冰箱，用于后期的PCR和western blot實驗。將血液標本離心，12 000 rpm，10 min，取上清，存于-80 ℃冰箱。采用ELISA法，按照試劑盒說明書，測定小鼠血清中炎癥因子鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin，CP)、IL-6、IL-1β、TNF-α等含量；比色法測定結腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性。

表1 DAI評分方法

1.4 PCR檢測指標及方法

取出結腸組織，用 RNA 提取試劑盒提取各組細胞中的RNA，逆轉錄合成 cDNA 后進行實時定量 PCR。使用 SYBR Green Real time PCR Master Mix 在 Roche Light Cycler 定量 PCR 儀上進行 PCR 檢測，以 U6 為內(nèi)參檢測目的基因相對表達水平。PCR 反應程序：95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性 30 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 20 s，連續(xù) 40 個循環(huán)。miR-155 相對表達量用 2-△△Ct描述。 miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB以及IL-1β、TNF-α、GAPDH等因子引物序，見表2。

表2 引物序列

1.5 western blot檢測TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表達情況

取小鼠結腸組織經(jīng) PBS 漂洗，組織裂解液提取總蛋白，聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉移至 PVDF 膜，TLR9抗體(1∶500)、MyD88(1∶500)NF-κB抗體(1∶1000)過夜(所有抗體購自Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA)，TBST漂洗，孵育二抗，室溫孵育1 h，TBST 漂洗，加入 ECL 暗室曝光，用 Image-J分析蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 兩組小鼠體重、DAI和結腸長度比較

采用3%DSS構建UC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)UC小鼠體重逐漸下降，與正常組小鼠比較，有顯著差異(P<0.05)；與正常組小鼠比較，UC小鼠DAI評分為(3.28±0.34)分，明顯升高(P<0.05)；此外，UC模型小鼠結腸長度為(3.52±0.18)cm，明顯低于正常組小鼠(7.05±0.37)cm，(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 結腸標本

2.2 兩組小鼠結腸組織MPO活性比較

髓過氧化物酶(MPO)活性可間接反映小鼠結腸炎癥水平。從實驗結果發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠比較，UC模型小鼠MPO活性明顯增加，見圖2。

表3 兩組小鼠體重、DAI和結腸長度比較

*與正常組比較，P<0.05

2.3 兩組小鼠血清炎癥因子CP、IL-6、IL-1β、TNF-α比較

采用ELISA法測定血清炎癥因子表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，UC模型組小鼠CP、IL-6、IL-1β、TNF-α明顯增加，提示UC小鼠炎癥反應增強，見表4。

表4 兩組小鼠血清炎癥因子LPS、IL-6、IL-1β、TNF-α比較(pg/mL)

2.4 兩組小鼠結腸組織miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB以及IL-1β、TNF-α mRNA水平比較

如圖3所示，與正常組比較，UC模型小鼠的miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB、IL-1β、TNF-α mRNA表達明顯增加。結果提示，UC小鼠免疫系統(tǒng)及炎癥反應被激活。

2.5 兩組小鼠TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表達情況

與正常組比較，UC小鼠結腸組織TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表達增加，提示TLR9信號通路可能參與UC的發(fā)生發(fā)展，見圖4。

*與正常組比較，P<0.05

*與正常組比較，P<0.05

3 討 論

UC發(fā)病率不斷增加，該疾病持續(xù)發(fā)展可導致結腸癌。UC發(fā)病機制較為復雜，受多種因素的相互作用。目前，臨床藥物治療仍然存在療效不穩(wěn)定、較易復發(fā)以及毒副作用較大等情況。因而，進一步研究UC的發(fā)病機制，或許為研發(fā)治療UC的藥物提供新的方向。UC患者普遍存在炎癥反應失衡的問題，表現(xiàn)為促炎因子高表達，抗炎因子水平下降的情況，同時UC患者可檢測到多種自身抗體，抗炎和抑制免疫反應從一定程度上改善UC患者的臨床癥狀，說明免疫功能紊亂與UC發(fā)生發(fā)展密切相關[6]。IL-1β、IL-6、TNF-α為重要的炎癥因子，鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin，CP)來源于中性粒細胞，其表達具有組織或細胞特異性，是中性粒細胞更新的重要標志物。本文研究發(fā)現(xiàn)，UC組小鼠血清CP及結腸組織MPO水平明顯高于正常組。

Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)為一種跨膜受體，具有識別病原微生物、促進抗菌基因表達及調(diào)控免疫反應等作用，在全身各器官具有表達[7]。UC患者腸道因腸道菌群的影響，導致急性損傷，進而引起相關信號通路的活化，促進NF-kB等因子的表達增加，加劇炎癥反應，使UC疾病惡化。TLR9是TLRs家族的重要成員，特異性地識別并結合細菌 DNA中具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸序列(cytosine phosphate-guanosine，CpG)，進而激活小鼠的免疫細胞。TLR9在B細胞、樹突細胞、單核細胞、T細胞及腸上皮細胞具有表達[8]。TLR9通過識別未甲基化CpG，募集MyD88，MyD88與IRAK結合，觸動IRAK-1，進而導致IRAK-1從復合體上解離，且與TRAF6相互作用，使TRAF6活化，進而激活TAK1，導致IkB激酶磷酸化，使NF-kB釋放并轉移至核內(nèi)。NF-kB活化可促進炎癥反應，使IL-6、TNF-α的生成增加。研究發(fā)現(xiàn)，UC大鼠結腸組織高表達TLR9、NF-kB，且與疾病惡化程度相關[9]。本文研究發(fā)現(xiàn)，UC模型小鼠結腸組織TLR9、MyD88、NF-kB的mRNA和蛋白明顯高于正常組小鼠，且UC小鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯高于正常組。提示，TLR9/NF-kB信號通路在UC發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。

miR-155位于人類21號染色體上，其表達水平受B細胞整合簇基因(B-cell integrationcluster，BIC)轉錄水平和miRNA加工等調(diào)控。脂多糖(LPS)刺激單核細胞可導致miR-155表達增加，而miR-155抑制劑可通過細胞信號傳導的抑制因子1(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)/ NF-kB信號通路下調(diào)LPS刺激的巨噬細胞的炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，在UC患者肌成纖維細胞(intestinal myelofibrosis，IMF)中 miR-155的表達明顯高于正?；颊?，miR-155可以通過抑制SOCS1表達，調(diào)節(jié)IMF炎癥表型，從而影響UC發(fā)生發(fā)展[10]。本文研究結果發(fā)現(xiàn)，miR-155在UC模型小鼠中的表達明顯增加，同時伴隨IL-1β、TNF-α及TLR9/NF-kB信號通路表達增強。提示，miR-155可能通過調(diào)控TLR9信號通路參與UC的炎癥反應，抑制該信號通路可能為治療UC的一個潛在靶點。