劉旭，單偉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

宮內(nèi)生長受限(intrauterine growth restriction，IUGR)是以新生兒出生體重低的方式表現(xiàn)出來[1]。據(jù)估計(jì)，其發(fā)病率約占妊娠的3%，并與圍產(chǎn)期死亡率和嚴(yán)重發(fā)病率相關(guān)，并對成人生活中的神經(jīng)發(fā)育和心血管健康產(chǎn)生不良影響。目前幾乎沒有預(yù)防或治療IUGR的方法或藥物。因此，減輕IUGR的發(fā)病率和影響在人類和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)中都是迫切需要的。

IUGR不僅與營養(yǎng)不良有關(guān)，還與氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激會引發(fā)低度炎癥。此外，IUGR胎兒的抗氧化防御系統(tǒng)被削弱，使氧化應(yīng)激加重。人參具有抗腫瘤、抗輻射、抑制中樞疲勞、改善微循環(huán)等作用。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，人參莖葉總皂苷對小鼠腎損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)及抗細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。這些研究也許會為進(jìn)一步研究人參莖葉總皂苷對治療IUGR提供一些研究思路。所以，本研究的目的在于明確人參莖葉總皂苷是否對妊娠期低蛋白飲食誘導(dǎo)的IUGR具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性和雌性只數(shù)按1∶2比例，體重200～230 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)提供[SCXK(遼)2017-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑及器材

人參莖葉總皂苷(純度82 %，新賓藥廠，批號20180312)，LC3和Beclin1抗體(上海生工生物有限公司)。IGF-1(Insulin-like growth factor 1)，GH(Growth hormone)，GHRH(Growth hormone releasing hormone)，SST(Somatostatin)，GSH(Reduced-glutathione)、INS(insulin)，T3(triiodothyronine)，T4(thyroxine)；SOD(Superoxide dismutase)、MDA(Malondialdehyde)等試劑盒均購于南京建成生物有限公司。

石蠟切片機(jī)(德國萊卡LEICA-RM2135)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司FACS Calibur)酶標(biāo)儀(中國DNM-9602G)、熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(以色列MF-ChemiBIS3.2)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，bx60日本)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備及動(dòng)物給藥

動(dòng)物分別在24 ℃和12 h的光照/暗循環(huán)下飼養(yǎng)3 d。雄性和雌性老鼠按1∶2的比例被放在籠子里。IUGR大鼠制備方法參照文獻(xiàn)[3]。具體方法如下：妊娠大鼠立即分為以下3組(n=8)。以空白組為對照組，飼喂20%(w/w)蛋白飼料。模型組與人參莖葉總皂苷組妊娠第11～21天給予8%(w/w) 低蛋白日糧誘導(dǎo)IUGR。人參莖葉總皂苷在妊娠第11～21天灌胃給藥，劑量為50 mg/kg。在出生后第1天，記錄胎鼠體重、器官重量、每胎仔數(shù)、死亡率和畸形。取胎鼠血清樣品，3000×g，離心15 min。

1.3.2 血清生化指標(biāo)檢測

胎鼠血清生化指標(biāo)(SST、GHRH、GH、INS、IGF-1、T3、T4)水平采用雙配體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，按照說明書測定。生化試劑盒檢測SOD、GSH、MDA。

1.3.3 光鏡分析

肝臟在4%多聚甲醛固定48 h。70%～95%乙醇1 h，100%乙醇為0.5 h 2次常規(guī)脫水，二甲苯透明，透明時(shí)間不固定，與組織塊大小有關(guān)；浸蠟2次，最后進(jìn)行包埋。石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為5 μm。HE染色，組織形態(tài)學(xué)觀察。切片用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢查。

1.3.4 流式細(xì)胞儀器檢測LC3和Beclin1蛋白的表達(dá)

取出肝臟，剪成0.5 cm小塊，放進(jìn)EP管，再將其剪碎，制備組織勻漿，過濾，離心取上清。加入LC3和Beclin1一抗，室溫孵育30 min。PBS洗滌2次，加入帶有Cy3標(biāo)記的熒光二抗，孵育30 min。PBS洗滌2次。流式細(xì)胞儀激光管提前預(yù)熱25 min，將儀器用熒光微球進(jìn)行調(diào)整。空白標(biāo)定為對照管，然后分析讀取數(shù)據(jù)，記錄標(biāo)本LC3和Beclin1蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 新生仔鼠數(shù)量的變化

與空白組比較，模型組新生仔鼠數(shù)量減少，差異顯著(P<0.05)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組新生仔鼠數(shù)量明顯增加，見表1。

表1 各組新生仔鼠數(shù)量測定結(jié)果

2.2 新生仔鼠的體重、臟器指數(shù)比較

表2可以看出，與空白組比較，模型組仔鼠平均體重明顯減少，差異顯著(P<0.05)，肝臟指數(shù)比、小腸指數(shù)比明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組仔鼠的平均體重體現(xiàn)出明顯增加，有顯著差異(P<0.01)，小腸指數(shù)比、肝臟指數(shù)比明顯減少(P<0.01)。

2.3 血清中生長發(fā)育相關(guān)因子檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組新生仔鼠血清中GHRH、GH明顯增加，IGF-1、SST、INS、T3 和T4明顯減少，差異顯著(P<0.001)；與模型組相比，人參莖葉總皂苷組GHRH，GH明顯減少，SST、INS、IGF-1、T3和T4明顯增加(P<0.01)，差異顯著(P<0.01)，見表3。

2.4 血清中抗氧化指標(biāo)比較

與空白組比較，模型組新生仔鼠血清中SOD與 GSH明顯減少，MDA明顯增加，差異顯著(P<0.01)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組SOD與 GSH明顯增加，MDA明顯減少，差異顯著(P<0.01)，見表4。

表2 各組新生仔鼠體重、臟器指數(shù)、IUGR發(fā)生率比較

表3 新生仔鼠血清中GHRH，SST，GH，INS，IGF-1，T3 和 T4檢測指標(biāo)

表4 新生仔鼠血清中SOD，GSH，MDA的比較

2.5 肝臟形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果

空白組新生仔鼠肝臟肝索排列不規(guī)則。肝索與肝索之間可以看見肝血竇，在肝血竇里有血細(xì)胞存在?？梢姸噙呅位驁A形的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞與肝細(xì)胞之間界限不清晰。肝細(xì)胞大多數(shù)是一個(gè)核，細(xì)胞核圓，位于細(xì)胞的中央，肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富。此外，還可以看見與不同發(fā)育階段肝細(xì)胞混合的髓樣造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞成群存在，細(xì)胞核呈小球形、圓形、著色較深。模型組，造血干細(xì)胞和血細(xì)胞較空白組減少；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組造血干細(xì)胞和血細(xì)胞增加，見圖1。

2.6 肝臟LC3和Beclin1蛋白的影響

與空白組比較，模型組新生仔鼠肝組織中LC3和Beclin1表達(dá)明顯增加，差異顯著(P<0.05)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組LC3和Beclin1明顯減少，差異顯著(P<0.05)，見圖2。

↓：髓樣造血干細(xì)胞

圖2 肝組織LC3和Beclin1蛋白的表達(dá)

3 討 論

基礎(chǔ)特征(新生仔鼠數(shù)量、死胎率和畸形率、新生仔鼠體重、臟器指數(shù)和IUGR發(fā)生率)、胎鼠血清生化指標(biāo)、形態(tài)學(xué)指標(biāo)表明，我們成功建立了IUGR的大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。對于治療，人參莖葉總皂苷可以改善以上指標(biāo)。提示人參莖葉總皂苷可能對IUGR大鼠有治療作用。

IUGR能夠改變下丘腦-垂體-腎上腺功能。生長激素(GH)是腦垂體前葉分泌的191種長鏈氨基酸激素，在促進(jìn)長骨生長、調(diào)節(jié)糖脂代謝、肝功能代謝和能量平衡等方面發(fā)揮重要作用。生長激素釋放激素(GHRH)和生長抑素(SST)均由下丘腦分泌。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，人參莖葉總皂苷降低了血清中GHRH和GH的水平，上升血清中SST水平。因此，我們認(rèn)為在IUGR中，人參莖葉總皂苷的作用與GHRH/SST/GH有關(guān)。

生長激素的作用可以通過胰島素樣生長因子1(IGF-I)間接介導(dǎo)，IGF-I在肝臟和其他組織中產(chǎn)生。胎齡小的新生兒IGF-1、胰島素(INS)水平明顯低于胎齡適宜的新生兒[4]。與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，人參莖葉總皂苷組血清中IGF-1和INS水平升高。結(jié)果表明，人參莖葉總皂苷影響IGF-1/INS通路介導(dǎo)的IUGR大鼠。

有研究表明，影響胎兒發(fā)育至關(guān)重要的因素是脂質(zhì)信號和能量的來源，而子宮內(nèi)脂質(zhì)含量的改變主要是原因是甲狀腺功能的減退[5]。胎兒組織的終末分化及一般組織的增生，會受到甲狀腺激素的調(diào)節(jié)，為胎兒的體外發(fā)育做準(zhǔn)備。IUGR嬰兒出生時(shí)血漿T3、T4減少[6]。我們的結(jié)果顯示，在IUGR中，T3和T4在出生時(shí)減少，人參莖葉總皂苷顯著增加了T4、T3的比例，提示人參莖葉總皂苷促進(jìn)了T4 、T3的產(chǎn)生。研究表明，人參原粉及人參水提物對正常成年大鼠的糖脂代謝及下丘腦-垂體-甲狀腺軸無明顯影響[7]。正常成年人參食用促甲狀腺激素、T3、T4、睪酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平均下降[8]。這些研究主要集中在正常成年動(dòng)物或成人，但是還沒有關(guān)于胎兒的報(bào)道。本研究未對母體激素進(jìn)行檢測，有待進(jìn)一步研究。

適當(dāng)?shù)淖允杀桓鼜V泛地認(rèn)為是對抗各種環(huán)境因素的基本細(xì)胞生存機(jī)制，而過度激活的自噬是加速細(xì)胞死亡的級聯(lián)反應(yīng)。增強(qiáng)的自噬可能是IUGR胎兒重要的機(jī)制[9]。LC3對自噬活性至關(guān)重要[10]。此外，自噬體形成所需的關(guān)鍵信號元件Beclin1和作為降解泛素化底物的選擇性自噬受體的p62也被用作自噬的標(biāo)記物[11]。人參皂苷在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑ψ允捎胁煌挠绊?。人參皂?Rg1抑制海馬神經(jīng)元異常自噬活動(dòng)有關(guān)[12]。人參皂苷Rb1可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)增加等[13]。也有報(bào)道認(rèn)為，人參皂苷Rg1處理組LC及Beclin 1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)[14]。我們的數(shù)據(jù)表明，人參莖葉總皂苷顯著降低了自噬水平。其對自噬的影響與前人研究一致。這可能與IUGR中IGF-1信號的激活有關(guān)。這些推測將在今后加以研究。脂質(zhì)過氧化作用于胎兒生長受限孕婦孕期明顯增強(qiáng)[15]。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)為抗氧化酶的重要組成部分，丙二醛(MDA)為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一。GSH 是體內(nèi)主要的抗氧化劑。我們的數(shù)據(jù)表明，人參莖葉總皂苷顯著拮抗了IUGR的氧化作用。

綜上所述，本研究表明，人參莖葉總皂苷可能在IUGR大鼠中發(fā)揮有效作用。這些作用可能與增加甲狀腺激素、GHRH/SST/GH、激活I(lǐng)GF-1/INS信號通路、抗氧化、減少自噬有關(guān)。