李 雍，林 峰，秦 勇，劉 偉，周雅琳，李睿珺，于蘭蘭，許雅君，

（1 北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系 北京100191 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京100029 3 新疆正生營養(yǎng)研究院 新疆昌吉830000 4 食品安全毒理學(xué)研究與評價北京市重點實驗室 北京100191）

“疲勞”是指因體力或腦力勞動過度，機體不能維持其原本的生理機能和/或運動強度。疲勞對于身體和認知層面都有一定的負面影響[1]，同時它也是一種向機體提供需要休息信號的機制，而繼續(xù)工作則會導(dǎo)致機體各系統(tǒng)一直處于低效率狀態(tài)，對消化、循環(huán)和免疫系統(tǒng)造成巨大傷害。緩解體力疲勞能夠在一定程度上提升耐力。延緩甚至消除疲勞已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)、食品和體育界學(xué)者近年來研究的熱點問題[2-3]。當(dāng)前已探索出多種具有緩解體力疲勞的植物及天然產(chǎn)物，如淫羊藿[4]、人參[5]和山藥[6]等。此外，目前研究還發(fā)現(xiàn)了一些具有緩解體力疲勞作用的功能因子，如多肽[7]、多糖、皂苷、生物堿和?；撬岬萚8]。

我國是玉米生產(chǎn)大國，但長期以來我國玉米制品多局限于玉米淀粉。玉米淀粉生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物——玉米麩質(zhì)粉中含有68%的醇溶蛋白，其高憎水性限制了它在食品中的廣泛應(yīng)用[9]。由玉米蛋白水解制成的玉米肽已被證明具有緩解體力疲勞，醒酒，降低血清中膽固醇濃度等多種保健食品的優(yōu)良功效[9-10]。本研究采用新疆特色粉質(zhì)型玉米品種，以傳統(tǒng)濕法所得玉米淀粉的副產(chǎn)物——玉米黃粉為原料制備玉米肽，評價玉米肽對體力疲勞的緩解作用。本研究建立了空白對照組和3種玉米肽劑量組，探究玉米肽對小鼠體力疲勞的緩解作用，為該地區(qū)玉米的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

以傳統(tǒng)濕法玉米淀粉副產(chǎn)物——玉米黃粉為原料，經(jīng)蛋白質(zhì)分離純化、蛋白酶酶解、純化、干燥等步驟獲得玉米肽。玉米肽分子質(zhì)量＜1 000 u，主要集中在576～132 u 范圍內(nèi)（占比80%）。凝膠色譜圖如1 所示。

酪蛋白，Sigma C5890，購自Sigma 公司；肝糖原測定試劑盒和全血乳酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其它試劑均為分析純級。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)條件

圖1 玉米肽凝膠色譜圖[11]Fig.1 Corn peptide gel chromatogram[11]

實驗動物為健康成年SPF 級ICR 雄性小鼠［使用許可證號：SCXX（京）2016-0010］160 只，體質(zhì)量18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度50%～60%，明暗交替12 h：12 h。

1.3 儀器與設(shè)備

SPN3001F 電子天平，美國奧豪斯公司；AU480 全自動生化分析儀，日本奧林巴斯公司；FLUO star Omega 多功能酶標儀，BMG LABTECH Inc 公司；BFX5-320 型低溫自動平衡離心機，白洋離心機廠；HH·S11-1 電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物分組及喂養(yǎng)方法 160 只雄性ICR 小鼠經(jīng)適應(yīng)期1 周后，稱重，按體重隨機分為4 組，分別為負重游泳組、肝糖原組、血乳酸組和血清尿素氮組，每組中均按體重再隨機分設(shè)4 個組：空白對照組、玉米肽低、中、高劑量組，空白對照組和不同劑量組每組各10 只。各組均給予維持飼料，自由進食、飲用無菌去離子水。

1.4.2 動物給藥方法 試驗期間每天早上8：00～10：00 對各劑量組進行灌胃，3 個劑量組分別給予不同劑量的受試樣品，分別為低劑量組：0.4 g/（kg bw）、中劑量組：0.8 g/（kg bw）、高劑量組：1.6 g/（kg bw），空白對照組經(jīng)口灌胃1.6 g/（kg bw）酪蛋白。試驗時間30 d，每隔5 d 記錄體重和攝食量。

1.4.3 小鼠負重游泳 （Weight loaded swimming，WLS）時間測定 取低、中、高3 個劑量組和空白對照組ICR 小鼠各10 只，于末次給予樣品30 min 后，將小鼠放入游泳箱中，水深30 cm，水溫（25.0±1.0）℃，鼠尾根部負荷5%體重的鉛塊，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間。

1.4.4 小鼠血清尿素氮含量測定 取低、中、高3個劑量組和空白對照組ICR 小鼠各10 只，于末次給予樣品30 min 后，將小鼠放入水溫為30 ℃的游泳箱中不負重游泳90 min，取出，休息60 min后摘眼球采血，離心取血清，利用全自動生化儀測定小鼠血清中尿素氮的含量。

1.4.5 小鼠肝糖原含量測定 取低、中、高3 個劑量組和空白對照組ICR 小鼠各10 只，于末次給予樣品30 min 后，立即處死，精確稱取肝臟100 mg，按肝糖原測定試劑盒使用步驟測定肝糖原含量。

1.4.6 血乳酸含量測定 取低、中、高3 個劑量組和空白對照組ICR 小鼠各10 只，于末次給予樣品30 min 后第1 次采血，不負重在溫度為30 ℃的游泳箱中游泳10 min 后取出立即第2 次采血，休息20 min 后第3 次采血。將上述3 個時間點的血樣，按全血乳酸測定試劑盒使用步驟測定血乳酸含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米肽對小鼠體重和食物利用率的影響

試驗期間動物體重和食物利用率變化如圖2～3 所示，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，各組動物的初始體重差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。整個試驗期間，各組動物的平均體重均呈現(xiàn)隨周齡增加而逐漸增加的趨勢。與對照組相比，玉米肽低、中、高劑量組小鼠體重及食物利用率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且玉米肽低、中、高劑量組小鼠活潑，皮膚光滑，精神狀態(tài)好，未見任何不良反應(yīng)。

作為實驗動物生長發(fā)育評價的重要指標，動物的體重和食物利用率是判斷受試物玉米肽是否為導(dǎo)致試驗結(jié)果中某項指標出現(xiàn)異常的重要評價標準[12]。本試驗中各組動物的體重及食物利用率均無顯著差異，說明玉米肽在試驗劑量范圍內(nèi)對小鼠生長發(fā)育和一般健康狀況無不良影響，從而可排除因玉米肽影響小鼠體重或食物利用率繼而造成試驗指標異常的可能性。

圖2 玉米肽對小鼠體重的影響Fig.2 Effects of corn peptide on the weight in mice

圖3 玉米肽對小鼠食物利用率的影響Fig.3 Effects of corn peptide on the utilization rate of food in mice

2.2 玉米肽對小鼠WLS 時間的影響

機體運動能力下降的主要原因為運動性力竭，它是疲勞的一種特殊形式，也是運動性疲勞的最后階段。體力疲勞的最主要表現(xiàn)是運動耐力的下降，而WLS 時間則是機體緩解疲勞能力最客觀、直接的指標[13-14]。在WLS 試驗中，對WLS 時長進行測定，試驗結(jié)果見表1，與空白對照組相比，低、中、高劑量組玉米肽均可延長雄性小鼠WLS時間，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 玉米肽對小鼠肝糖原含量的影響

糖原是運動過程中重要的能量來源，肝臟中糖原的儲存與高強度的運動能力有關(guān)。肝糖原含量的增加可以有效增強運動耐力，故肝糖原可以作為疲勞的另一個參數(shù)[15]。玉米肽對小鼠肝糖原含量的影響見表2，與空白對照組相比，玉米肽中劑量組能顯著提高雄性小鼠肝糖原含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 玉米肽對小鼠血清尿素氮含量的影響

正常生理狀態(tài)下，機體尿素的生成與排泄處于平衡狀態(tài)。劇烈運動則會使機體長時間不能通過分解代謝獲得足夠能量，使得蛋白質(zhì)與氨基酸的分解代謝水平提高，進而導(dǎo)致血液中尿素含量升高。研究表明，血清尿素氮含量與機體運動耐力呈顯著負相關(guān)。因此，機體抗疲勞的能力在一定程度上體現(xiàn)為血清尿素氮含量[16]。玉米肽對小鼠運動后血清尿素氮含量的影響如表3所示。與空白對照組相比，玉米肽低、中、高各劑量組均可降低運動后血清尿素氮含量，中劑量組血清尿素氮含量的降低具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 玉米肽對小鼠WLS 時間的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of corn peptide on mice in time of WLS（±s，n=10）

表1 玉米肽對小鼠WLS 時間的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of corn peptide on mice in time of WLS（±s，n=10）

注：* 表示與空白對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

組別 WLS 時間/s空白對照組 568.10±153.49玉米肽低劑量組 1 210.40±294.25*玉米肽中劑量組 1 558.30±503.66*玉米肽高劑量組 1 175.80±370.48*

表2 玉米肽對小鼠肝糖原含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of corn peptide on mice in hepatic glycogen contents（±s，n=10）

表2 玉米肽對小鼠肝糖原含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of corn peptide on mice in hepatic glycogen contents（±s，n=10）

注：* 表示與空白對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

組別 肝糖原含量/mg·g-1空白對照組 19.02±1.96玉米肽低劑量組 20.75±1.28玉米肽中劑量組 24.46±3.65*玉米肽高劑量組 19.73±2.08

表3 玉米肽對小鼠血清尿素氮含量的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of corn peptide on mice in serum urea nitrogen contents（±s，n=10）

表3 玉米肽對小鼠血清尿素氮含量的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of corn peptide on mice in serum urea nitrogen contents（±s，n=10）

注：* 表示與空白對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

?組別 血清尿素氮含量/mmol·L-1空白對照組 9.80±0.85玉米肽低劑量組 9.50±1.34玉米肽中劑量組 8.90±0.59*玉米肽高劑量組 9.27±0.62

2.5 玉米肽對小鼠血乳酸含量的影響

乳酸是一種重要的代謝產(chǎn)物，在強化運動期間積聚并會導(dǎo)致肌肉和血液的pH 值降低，從而抑制肌肉收縮并引起疲勞[17]。因此，乳酸是衡量運動后疲勞程度的重要指標，可通過抑制乳酸的積累和加速乳酸的清除2 種機制來產(chǎn)生抗疲勞功效。玉米肽對小鼠運動前、運動后0 min 和運動后20 min 血乳酸含量的影響如表4所示。小鼠游泳前與對照組相比，各劑量組血乳酸含量在同一水平上，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。游泳后0 min 各劑量組血乳酸水平較游泳前均明顯升高，說明游泳使小鼠體內(nèi)堆積大量乳酸，但各劑量組較之空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明玉米肽不能抑制乳酸的積累。游泳結(jié)束休息20 min 后，各劑量組血乳酸水平較剛游泳后有所降低，接近游泳前水平，玉米肽各劑量組的降幅均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而各劑量組乳酸曲線下面積與對照組相比雖有所降低但亦無顯著性差異（P＞0.05）。該試驗結(jié)果表明玉米肽未能顯著降低小鼠運動后血乳酸含量。

表4 玉米肽對小鼠運動后血乳酸含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of corn peptide on mice in blood lactic acid levels and AUC （±s，n=10）

表4 玉米肽對小鼠運動后血乳酸含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of corn peptide on mice in blood lactic acid levels and AUC （±s，n=10）

組別 血乳酸含量/mmol·L-1游泳前 游泳后0 min 游泳后休息20 min 血乳酸曲線下面積空白對照組 7.27±3.34 9.72±2.33 8.55±3.74 271.06±36.05玉米肽低劑量組 7.18±4.13 9.46±1.46 8.09±2.76 268.44±24.41玉米肽中劑量組 7.67±2.16 9.29±1.29 8.03±2.54 261.90±26.94玉米肽高劑量組 7.16±2.49 9.25±2.62 7.61±2.18 260.25±13.42

3 結(jié)論與討論

疲勞會引起神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)生物調(diào)節(jié)相關(guān)的各種疾病。研究顯示，通過食用蛋白質(zhì)、肽或氨基酸進行運動后營養(yǎng)補充可以緩解體力疲勞，恢復(fù)體力。肽作為小分子的營養(yǎng)補充劑，不僅可以被機體快速、輕松地吸收而不受氨基酸的競爭抑制，還可以促進氨基酸、蛋白質(zhì)和葡萄糖的利用。因此，肽可用于緩解和抵抗體力疲勞。

本研究以ICR 雄性小鼠為研究對象，灌胃不同劑量玉米肽30 d，以WLS 時間、肝糖原含量、游泳后血清尿素氮和血乳酸含量為研究指標，探究玉米肽緩解體力疲勞的作用。試驗結(jié)果顯示玉米肽各劑量組均可延長小鼠WLS 時間，提高肝糖原含量并降低血清尿素氮水平。

WLS 試驗通常在動物實驗中用作評估身體疲勞和運動劇烈程度導(dǎo)致身體應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)垂體腎上腺皮質(zhì)激活的模型[5，18]。本試驗中玉米肽3 個劑量組WLS 時間與空白組WLS 時間相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示玉米肽可以緩解由強迫負重游泳運動產(chǎn)生的身體疲勞。然而，3 個劑量組之間的WLS 時間無顯著性差異（P＞0.05），其中中劑量組表現(xiàn)較好，而高劑量組WLS 時間低于中劑量組，分析原因可能是在一定范圍內(nèi)，隨著玉米肽劑量的增加其延長WLS 時間的效應(yīng)也隨之增加，而當(dāng)玉米肽超過某一劑量時，延長效應(yīng)不再改變。

當(dāng)前關(guān)于長時間劇烈運動引起疲勞的理論機制有以下幾種：“疲憊理論”、“阻塞理論”、“自由基理論”和“穩(wěn)態(tài)干擾理論”等[3]。其中“疲憊理論”表明，在運動過程中，能量來源如肝、肌糖原的耗盡，血清尿素氮、乳酸等代謝物的積累以及自由基的產(chǎn)生均能導(dǎo)致疲勞[17，19]。故在評估這類由強迫運動或游泳等引起身體疲勞的高強度運動能力時，肝糖原的水平尤為重要，它可以在饑餓或運動時分解為葡萄糖以維持血糖水平，其儲存及分解速率可直接影響運動能力和持續(xù)時間，故肝糖原的含量可以反映疲勞程度，增加肝糖原儲存有助于提高耐受能力和運動能力[20]。研究結(jié)果顯示，低、中、高3 個劑量組的小鼠肝糖原水平均有所增加，但僅有中劑量組肝糖原水平顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

同時“疲憊理論”中提到的血清尿素氮和血乳酸的積累水平也同樣重要?！白枞碚摗币餐瑯颖砻餮樗岷脱迥蛩氐倪^度積累會導(dǎo)致代謝紊亂從而產(chǎn)生疲勞。在劇烈運動期間，腺苷酸分解代謝升高且糖原儲存不足時，蛋白質(zhì)開始分解以產(chǎn)生能量。蛋白質(zhì)和氨基酸代謝會產(chǎn)生NH3和CO2，繼而引發(fā)尿素在肝臟中合成。在正常生理條件下，尿素的形成和排泄保持平衡。然而，在長時間運動后，為滿足能量需求，蛋白質(zhì)氧化增加，導(dǎo)致尿素氮（包括血清尿素氮）水平顯著上升。血尿素氮水平是與疲勞相關(guān)的敏感參數(shù)并與運動耐量呈顯著負相關(guān)[3]，通常用于評估動物承受運動負荷時的耐受能力，動物對于運動的適應(yīng)能力越低，血清尿素氮的水平越高[21]。 本研究結(jié)果顯示，玉米肽中劑量組的血清尿素氮水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明玉米肽的處理減弱了氨基酸和蛋白質(zhì)分解代謝誘導(dǎo)的血清尿素氮水平的增加，增強了物理負荷的適應(yīng)能力并最終提高機體對于長時間劇烈運動的耐受能力。

哺乳動物對運動的反應(yīng)始于有氧肌肉活動的增加，如果運動強烈，則會轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝，從而導(dǎo)致血乳酸積累。因此，血乳酸的積累是產(chǎn)生疲勞的重要原因。乳酸含量的增加會降低肌肉組織和血液的pH 值，影響心血管循環(huán)系統(tǒng)和骨骼肌系統(tǒng)的功能，進而對身體機能產(chǎn)生危害，使得肌肉收縮力下降，最終導(dǎo)致疲勞[21]。因此，乳酸含量也是評估疲勞水平的另一重要指標。本研究結(jié)果顯示，玉米肽各劑量組對小鼠游泳前與游泳后0，20 min 的血乳酸含量均無明顯影響（P＞0.05），說明玉米肽未能有效減緩機體運動時乳酸的產(chǎn)生，且未能加速運動后血乳酸的代謝。然而，其它關(guān)于緩解體力疲勞的試驗中也有該現(xiàn)象的出現(xiàn)[22-24]，其原因還有待于后續(xù)進一步研究。

本試驗研究結(jié)果提示在一定劑量下，由新疆地區(qū)特色粉質(zhì)型玉米酶解獲得的玉米肽具有緩解體力疲勞的功能，為該特色玉米品種開發(fā)具有緩解體力疲勞功能的產(chǎn)品提供了一定的證據(jù)支持，拓展了該地區(qū)特色粉質(zhì)型玉米品種的商業(yè)用途并豐富了緩解體力疲勞可能的天然植物資源。