常 成，陳藝煊，曹菲薇，陳 娟，鄭煬凡，朱加進

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 杭州310000）

青春期是機體生長發(fā)育的重要時期，它決定著人的體質、智力和精神狀態(tài)[1]。青少年能否健康成長不僅受遺傳因素的影響，而且與適當的營養(yǎng)，特別是各種宏觀和微量元素密切相關[2]。長期以來，我國居民膳食結構不合理，鈣、鋅、硒、鎂缺乏嚴重[3]，而在所有人群中，11～13 歲的青少年膳食中礦物元素水平達到DRI （膳食營養(yǎng)素參考攝入量）的比例最低。同樣的，美國的調查數據也顯示，8～19 歲的青少年、兒童膳食鈣攝入量達到AI（適宜攝入量）的比例最低[4]。除攝食外，機體還可通過飲水獲取礦物元素。關于飲水這一途徑，國內外存在廣泛的爭議：一種觀點認為，人體所需的礦物元素95%是由膳食提供，沒有必要通過飲水獲得；另一種觀點則認為，水中的礦物元素以離子態(tài)存在，相較于食物具有明顯較高的生物利用度[5]，因此飲水是機體獲取礦物元素不可缺少的途徑。此外，最近的研究發(fā)現，通過攝食獲取礦物元素有增加能量攝入的風險，相反的，飲水則可以通過被稱為“水誘導熱生成” 的機制提高REE （靜息能量消耗），對于減少青少年的肥胖率具有重要的現實意義[6-8]。

由于青少年的大部分活動在學校完成，實際上可供他們選擇的日常飲水為白開水和瓶裝水。作為白開水原料的自來水，提供了機體每日所需鋅攝取量的10%[9]，然而，自來水易受生物和化學污染[10]，在自來水消毒過程中，各種消毒劑可在水中產生DBPs（消毒副產物），特別是三氯甲烷[11-12]。此外，自來水管道和水龍頭中的銅也可能浸出進入自來水中[13-14]，因此，消毒劑和DBPs 帶來的不愉快氣味和重金屬暴露使得人們越來越多地選擇瓶裝飲用水。市場上最受歡迎的瓶裝飲用水是瓶裝天然水和瓶裝純凈水，由于水源和過濾方式的不同，瓶裝純凈水幾乎不含礦物元素，而瓶裝天然水則含有一定量的礦物元素。

研究發(fā)現，3 種常見飲水的成分和礦物元素含量不同，可能對機體健康產生不同的影響。長期飲用純凈水會導致鎂攝入不足[15-16]，對脂蛋白代謝和脂質過氧化產生負面影響[17-18]。在水中添加鋅可促使蝦虎魚增加脂肪分解，減少脂肪生成[19]。此外，軟水區(qū)的冠心病或其它心血管疾病的死亡率高于硬水區(qū)[20-21]。也有研究發(fā)現3 種飲用水對一些發(fā)育指標并無差異。王娟等[22]觀察到大鼠飲用3種水1年后，其尿、血液、毛發(fā)和肝臟中氟、銅、鐵、鋅、鍶的含量沒有差異；Zhao 等[23]發(fā)現長期飲用純凈水的大鼠與飲用自來水的大鼠相比，親代體重、繁殖、子代生長發(fā)育無明顯差異。

斑馬魚（Danio rerio）是一種新型模式脊椎動物，其基因與人類同源性高達87%[24]，具有許多其它傳統(tǒng)模式動物所不具備的優(yōu)點，如體積小，生命周期短，易于飼養(yǎng)等。此外，斑馬魚是一種體外受精和體外發(fā)育的動物，生理過程與人類非常相似[25]，廣受科研人員的青睞。研究發(fā)現，水環(huán)境對斑馬魚的生長發(fā)育、生理和病理都有很大的影響[26]。將斑馬魚用于水質安全檢測，在國內外已得到公認和廣泛應用。鑒于國際社會對飲食狀態(tài)下日常飲水的爭議，加之以往的研究大多集中于不同飲用水對婦女和中老年人群的影響，很少有研究比較長期飲水對青少年人群機體的影響，本研究比較了在膳食提供充足礦物元素的情況下，3 種常見飲水對斑馬魚幼魚的發(fā)育行為、脂代謝和抗氧化能力的影響，并分析何種礦物元素造成這些差異，旨在為處于人生重要階段的青少年的日常飲水選擇提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 斑馬魚（Danio rerio）〔許可證編號：ZJU（浙江大學）2015-8-26-004Y〕，體長（4.754±0.159）mm，浙江大學動物科學學院教育部分子動物營養(yǎng)重點實驗室（杭州）。

1.1.2 試劑 海鹽，浙江海藍星鹽制品有限公司；豐年蝦（Artemia）卵，天津豐年水產養(yǎng)殖有限公司；固體顆粒飼料（粗蛋白＞50.0%，粗脂肪＞12.0%，粗纖維＜2.5%），Zeigler larval；MS222，Sigma-Aldrich。

所有試劑盒均購自南京建城生物工程研究所。總蛋白定量測定試劑盒A045-2；甘油三酯（TG）測定試劑盒A110-2；總膽固醇（TC）測定試劑盒A111-2；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒A112-2；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒A113-2；丙二醛 （MDA）測定試劑盒A003-1；總膽固醇超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒A001-1-1。

1.1.3 水樣與飲食 養(yǎng)魚水為0.06 g 海鹽和1 L蒸餾水（最終質量濃度約為0.06 mg/mL）的混合物；自來水為曝氣24 h 后的杭州市市政自來水；瓶裝天然水和瓶裝純凈水購自超市。21～30 dpf（受精后天數）斑馬魚每日喂食2～3 次新鮮孵化的豐年蝦幼蟲；30 dpf 后的斑馬魚每日喂食2～3 次新鮮孵化的豐年蝦幼蟲和固體顆粒飼料。

1.1.4 儀器設備 原子吸收光譜儀（AA240 型），Varian；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 （730-ES型），Varian；pH 計，METTLER TOLEDO；電導率測定儀（HI98303 型），HANNA；數字鼓風機干燥器（GZX-9030MBE 型），BOXUN；智能生化培養(yǎng)箱，SPX；超聲破碎機（DL-1000D 型），ZhiXin；離心機（T3，15A 型），ThermoScientific；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1900 型），PERSEE。

1.2 試驗設計

如圖1所示，將21 dpf 斑馬魚幼魚（體長4.754 mm±0.159 mm，n=240）隨機分為4 組：FWG（養(yǎng)魚水組，對照組）、PWG（純水組）、NWG（天然水組）和TWG（自來水組），每組20 尾，每組設置3個平行。每組斑馬魚在相應的水樣中飼養(yǎng)，每日更換1/3 的新鮮水樣以確保水中溶解氧水平。所有斑馬魚在試驗期間均飼喂相同的食物，以排除食物中的礦物元素對試驗結果的干擾。斑馬魚自由進食，保證每次喂食在5 min 內攝食完成。

1.3 指標觀察與測定

1.3.1 水樣水質與組分的測定 根據GB5749-2006 和GB-7489-1987，測定4 種水樣的pH 值、總溶解固體（TDS）、溶解氧（DO）和鉀、鈣、鈉、鎂、鐵、鋅、銅含量。其中，玻璃電極法測定pH 值；稱重法測定TDS，干燥溫度（105±3）℃；吲哚法測定DO；火焰原子吸收光譜法測定鉀含量；電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定鈣、鈉、鎂、鐵、鋅和銅的含量。

2011年3月召開的全國人大會議上通過了 “十二五”規(guī)劃。“十二五”規(guī)劃在稅收方面提出“擴大增值稅征收范圍，相應調減營業(yè)稅等稅收”的任務。這是繼2009年進行增值稅轉型以后再次進行的關于增值稅的改革。目前，擴大增值稅征收范圍改革已經進行了三年，改革成果有喜有憂，筆者通過對近三年來擴大增值稅征收范圍改革的成果進行總結歸納，提出自己的見解，為擴大增值稅征收范圍改革建言獻策，推動改革早日完成。

1.3.2 存活率記錄 在整個試驗階段，每天記錄各組斑馬魚的死亡尾數并繪制存活率曲線。

1.3.3 90 dpf 斑馬魚體重和體長的測定 試驗結束前24 h，所有斑馬魚停止進食。試驗當天，用MS222（Sigma-Aldrich）對斑馬魚進行安樂死，用濾紙徹底吸收斑馬魚表面殘留的水分后測量全魚的體重和體長。

圖1 試驗設計示意圖Fig.1 Schematic illustration of the study design

1.3.4 90 dpf 斑 馬 魚 體 內K、Na、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu 含量的測定 斑馬魚安樂死后，按質量（g）∶體積（mL）=1∶9，加入生理鹽水，在冰水浴中用超聲波破碎機勻漿，直到組織混合物均勻化，4 ℃，5 000×g 離心30 min 后取上清液得到10%的斑馬魚勻漿。稀釋10 次后，用火焰原子吸收光譜法測定全魚K 含量，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定Na、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu 含量。

1.3.5 90 dpf 斑馬魚脂代謝指標的測定 根據相應的試劑盒說明書測定全魚蛋白質、TG、TC、HDL-C 和LDL-C 水平。

1.3.6 90 dpf 斑馬魚抗氧化能力指標的測定 根據相應的試劑盒說明書測定全魚SOD 活性和MDA 水平。

1.4 數據處理

采用SPSS 16 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數據采用單因素方差分析和LSD 檢驗進行分析。采用Pearson 二元相關分析法，對水樣組分與斑馬魚生長發(fā)育、脂代謝及抗氧化指標之間的相關性進行分析。所有數據均以±s 表示，P ＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4 種水樣的水質指標與組分含量

如表1所示，與自來水相比，2 種瓶裝水的pH 值和TDS 水平較低，但DO 水平較高，此外，天然水的pH、TDS 和DO 水平高于純凈水；自來水中的鉀、鈉、鈣、鎂等礦物元素含量高于瓶裝水，天然水中的礦物元素含量高于純凈水；純凈水的鈣鎂比為13∶1，養(yǎng)魚水3∶1，天然水7∶1，自來水8∶1；自來水中鋅含量最高。此外，4 種水樣中的鐵和銅含量均遠遠低于GB 5749-2006 規(guī)定的限值（鐵＜0.3 mg/L，銅＜1.0 mg/L）。

表1 4 種水樣的水質指標和組分含量Table 1 The water quality indexes and components of the four waters

2.2 4 種水樣中斑馬魚的發(fā)育行為

如圖2所示，試驗第1 天，PWG 和NWG 中有數尾斑馬魚幼魚發(fā)生死亡，導致存活率低于FWG和TWG；25 dpf，PWG 中斑馬魚幼魚繼續(xù)大量死亡，TWG 中斑馬魚幼魚開始出現死亡現象，而FWG 和NWG 中的死亡率趨于平緩；60 dpf，NWG、TWG 和FWG 中的斑馬魚幼魚均停止死亡，而PWG 中仍有少數死亡；90 dpf，PWG 中斑馬魚的生存率最低，其余3 組生存率無顯著差異。

圖2 21～90 dpf 4 組水樣中斑馬魚幼魚的存活率曲線Fig.2 The survival curve of zebrafish juvenile in four groups from 21 dpf to 90 dpf

2.3 90 dpf 斑馬魚體內K、Na、Ca、Mg、Fe、Cu和Zn 含量

4 組間K、Na、Mg、Cu 含量無顯著差異（圖3a、b、d、g）；PWG 中斑馬魚體內Ca 含量顯著低于NWG 和TWG（P=0.013，0.022）（圖3c）；FWG 中斑馬魚體內Fe 含量顯著高于其它3 組，PWG 中斑馬魚體內Fe 含量極顯著高于TWG （P=0.009）（圖3e）；PWG 中斑馬魚體內Zn 含量顯著低于TWG（P=0.048）（圖3f）。

表2 90 dpf 各組斑馬魚的體重和體長Table 2 The body weight and body length of 90 dpf zebrafish

圖3 4 種水樣中90 dpf 斑馬魚體內礦物元素含量Fig.3 The mineral levels of 90 dpf zebrafish in four different waters

2.4 90 dpf 斑馬魚脂代謝水平

90 dpf，TWG 中斑馬魚體內TG 含量較FWG組顯著下降，PWG 中斑馬魚體內TG 含量顯著高于NWG （P=0.016）和TWG （P=0.001）（圖4a）；NWG 中斑馬魚體內HDL-C 水平顯著高于FWG和PWG （P=0.002，0.041）（圖4c）；4 組間TC 和LDL-C 水平無顯著差異（圖4b、d）。

圖4 90 dpf 斑馬魚體內TG 水平（a）、TC 水平（b）、HDL-C 水平（c）和LDL-C 水平（d）Fig.4 90 dpf zebrafish TG level （a），TC level （b），HDL-C level （c）and LDL-C level （d）

2.5 90 dpf 斑馬魚抗氧化能力

90 dpf，4 組水樣中斑馬魚SOD 活性無顯著差異 （圖5a）；PWG 中斑馬魚MDA 水平顯著高于NWG（圖5b）。

圖5 90 dpf 斑馬魚SOD 活性（a）和MDA 水平（b）Fig.5 90 dpf zebrafish SOD activity （a）and MDA level （b）

2.6 4 種水樣的組分與90 dpf 斑馬魚體內礦物元素含量、發(fā)育參數、脂代謝指標、抗氧化能力的關系

如表3所示，90 dpf 斑馬魚的存活率與幾乎所有的水樣指標與組分有關；體長與水樣中Ca（P=0.040）和Mg 含量（P=0.020）呈正相關；TG 水平與水中K 含量呈正相關（P=0.001），而與水中Ca（P=0.001）、Mg（P=0.000）、Fe（P=0.010）和Zn（P=0.010）含量呈負相關；HDL-C 水平與水中Na 含量呈負相關（P=0.022）。

3 討論

3.1 不同飲水對斑馬魚幼魚發(fā)育行為的影響

Lawrence[27]發(fā)現大多數淡水魚適宜在pH 7.0～8.0 內的水體中生存，Naddy 等[28]發(fā)現天然水體中的Ca∶Mg 在1.6∶1～8∶1 間，也就是說，除了瓶裝純凈水外，本試驗中其它3 種水樣都適合斑馬魚幼魚的生長發(fā)育，這與我們所得的生存率曲線結果一致（圖2）。此外，值得注意的是，自來水DO僅為1.68 mg/L，低于Erickstad 等[29]建議的魚類死亡和回避行為的下限值2.8 mg/L。然而，我們并未在TWG 中觀察到斑馬魚幼魚的任何異常行為，推測有兩個原因：第一，本試驗所使用的斑馬魚（21 dpf）比Erickstad 等[29]試驗所使用的斑馬魚（7 dpf）日齡大，因而抵抗能力與適應能力更強；第二，當水體中DO 降至3 mg/L 以下時，斑馬魚能迅速提高SOD 活性以適應輕度缺氧，直到DO＜1 mg/L 才會發(fā)生氧化損傷[30]，這與我們觀察到的TWG 中斑馬魚幼魚體內SOD 活性有上升趨勢的現象相一致（圖5a）。

有研究報道飲用純凈水能顯著降低缺鎂飲食大鼠的體重[31]，青春期前的鈣攝入量嚴重影響青少年的身高增長[32-35]，鈣攝入低于300 mg/d 可能會導致成人身高變矮[36]。我們的試驗結果發(fā)現，PWG 中斑馬魚幼魚的體重和體長顯著下降，與前人的研究結果相一致。相關分析表明，斑馬魚幼魚的體長與水中Ca、Mg 的含量呈顯著正相關，體重與體內Zn 含量呈顯著正相關，而幼魚體內Zn 含量又與水中Ca、Mg 的含量呈顯著正相關。因此，可以得到結論：純凈水組斑馬魚幼魚的體重和體長顯著降低可能是由于純凈水中缺乏鈣和鎂所致。

3.2 不同飲水對斑馬魚幼魚脂代謝的影響

冠狀動脈疾病已經成為當今世界人口死亡的主要原因，多種現象提示疾病的早期發(fā)生，包括低HDL-C、高LDL-C、高TC、高TG[37]。相關分析表明，斑馬魚幼魚TG 水平與水樣中Ca、Mg、Fe、Zn的水平呈顯著負相關，與水樣中K 的水平呈顯著正相關。Papakonstantinou 等[38]發(fā)現喂食高鈣飲食的老鼠比對照組的老鼠胴體脂肪減少29%。研究表明，高濃度的鈣至少通過2 種機制抑制膳食脂肪酸的吸收：第一，抑制相關的循環(huán)激素水平，如25-羥基維生素D、1，25-二羥基維生素D 和甲狀旁腺激素[39]；第二，促進胃腸道中不可消化鈣皂的形成[40-41]。此外，Ravn 等[42]發(fā)現，當實驗動物接受具有足夠鎂含量的標準小鼠食物時，鎂能顯著降低ApoE-/-小鼠體內的TG 水平，然而，Orimo 等[43]發(fā)現，膽固醇飲食喂養(yǎng)的兔子并無脂質水平的差異。這兩項研究結果不一致的原因可能與前一研究中鎂是通過飲水干預而后一研究中則是通過膳食干預有關。

相關分析還表明，斑馬魚幼魚體內HDL-C 水平與水樣中Ca、Mg 水平呈顯著正相關，與Na 水平呈顯著負相關。這一結果與前人的一些研究相一致：Delisle 等[44]發(fā)現正常HDL-C 水平人群的鈣攝入量明顯高于低HDL-C 水平人群，并且HDLC 水平隨著鎂攝入量的增加而顯著升高[45]；Choi等[46]提示膳食鈉攝入量與血清HDL-C 水平呈負相關。然而，也存在一些研究結果不一致：Aslanabadi 等[47]發(fā)現，攝取富含鈣、碳酸氫鎂和硫酸鹽的礦泉水1 個月后，血脂異常的成年人群的TC 和LDL-C 水平顯著下降，但TG 和HDL-C 水平無顯著變化。我們推測這可能是由于他們的試驗對照組使用的水含有比本試驗明顯較高的鈣（7 mg/L）和鎂（1.7 mg/L）。由此可見，純凈水組斑馬魚幼魚體內TG 和HDL-C 水平的顯著下降是由于瓶裝純凈水中鈣、鎂的缺乏。

3.3 不同飲水對斑馬魚幼魚抗氧化能力的影響

Zn 0.907**0.542-0.099 0.741*0.132 0.771*0.843**-0.502 0.522-0.275-0.799*0.145-0.206-0.055析分性關相的力能化氧、抗標指謝代、脂數參育、發(fā)量含素元物礦內體魚馬90 dpf 斑與分組的樣水4 種3表Correlation analysis of the relationship among water constituents，90 dpf zebrafish mineral levels，developmental parameters，Table 3 lipid metabolism and antioxidant parameters Fe Mg Ca MDA SOD LDL-C HDL-C TC TG長體重體率存生-0.214 0.211 0.132-0.233 0.255 0.228 0.136 0.134 0.539**0.321*0.286*0.733**pH樣水0.57-0.027 0.191-0.147 0.3 0.053-0.279 0.192-0.221 0.127 0.167 0.860**TDS樣水0.102 0.164 0.400-0.194-0.319*0.006 0.290-0.365*0.172 0.095-0.005-0.194 DO樣水-0.433 0.154-0.08-0.103 0.269 0.203 0.118 0.203 0.505**0.235 0.224 0.5**K樣水0.936**-0.143 0.312-0.104 0.157-0.076-0.374*0.075 0.085-0.004 0.039 0.64**Na樣水-0.554 0.216-0.039-0.139 0.212 0.231 0.229 0.141-0.522**0.273*0.239 0.434**Ca樣水-0.462 0.234 0.041-0.188 0.216 0.241 0.227 0.122-0.54**0.307*0.265 0.538**Mg樣水0.495-0.051 0.277-0.036-0.285-0.144-0.021-0.277-0.414**-0.113-0.142-0.293*Fe樣水-0.417 0.041-0.252 0.026 0.302 0.139-0.014 0.286-0.413*0.115 0.147 0.356**Zn樣水0.222 0.09 0.353-0.133-0.327*-0.051 0.198-0.349*0.274 0.014-0.064-0.275*Cu樣水0.005 0.653*0.187 0.082-0.351-0.163-0.011*-0.115-0.6-0.605*-0.793**-0.032 Na魚馬斑0.19 0.583 1-0.249-0.295-0.286 0.185-0.554**-0.37 0.109-0.068 0.452*Ca魚馬斑-0.132 1 0.583 0.098-0.111 0.268 0.483-0.33-0.677*-0.255-0.59 0.168 Mg魚馬斑-0.206 0.145 0.161 0.344 0.702 0.794*-0.111-0.218 0.761*0.768*0.839**Zn魚馬斑：*P＜0.05；**P＜0.01。注

超氧化物歧化酶（SOD，一種催化超氧自由基歧化成氧氣或過氧化氫的酶）是機體細胞抗氧化劑對ROS 和脂質過氧化造成的氧化損傷的第一道保護線[48]，研究發(fā)現魚能夠利用SOD 將超氧化物歧化為氧[49]。有趣的是，本研究發(fā)現斑馬魚幼魚體內的SOD 活性并未受到不同水樣的影響，說明所有組斑馬魚幼魚都表現出相似的抗氧化能力，這一結果與其它對海水魚類的研究不一致，但與對亞淡水魚類的研究結果一致[50-52]。原因可能是淡水魚類通常比海水魚類暴露于更寬pH 范圍的水體中，因此0.8 單位的pH 變化不足以誘導氧化應激反應的發(fā)生。此外，研究發(fā)現鎂具有抗脂質過氧化作用[53]，并能維持SOD 活性[54]。Han 等[55]發(fā)現，當膳食補充1 mg/kg 鎂時，高氟牛體內SOD 活性顯著增加。這些研究也與本研究結果不一致，可能是因為在本試驗中各水樣中鎂含量只有很小的差異，并且斑馬魚并未處于氧化應激狀態(tài)。

一旦自由基突破生物體對氧化的防線，ROS即可攻擊誘導氧化損傷的細胞分子，MDA 水平被認為是脂質過氧化最重要的表現之一[56-57]，因此可以通過測量MDA 水平來評估斑馬魚幼體脂質過氧化的水平。本試驗結果與前人相一致，純凈水中斑馬魚幼魚體內MDA 水平的顯著增加可能歸因于水樣中鎂的缺乏，鎂具有抗脂質過氧化作用，鎂缺乏導致脂質過氧化增加，鎂缺乏動物對氧化應激比正常動物更敏感。

4 結論

3 種常見飲水相比較，瓶裝天然水具有適宜的pH 和DO、適量的礦物元素水平以及合理的鈣鎂比，對斑馬魚幼魚的生長發(fā)育、脂質代謝和抗氧化能力表現最佳，自來水次之，而瓶裝純凈水則由于缺乏鈣、鎂而不適合斑馬魚幼魚的生長與健康發(fā)育。本研究表明，即使在膳食能夠提供充足的礦物元素的情況下，長期飲用純凈水仍會對機體發(fā)育、脂質代謝和抗氧化能力產生一定的不利影響，這為消費者特別是處于生長發(fā)育重要階段的青少年選擇適當的飲水提供了一定的參考。