安 陽(yáng)，馬武開，黃 穎，曹躍朋，寧喬怡，劉 靜,楊慶萬，項(xiàng)飛燕

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以反復(fù)發(fā)作的四肢對(duì)稱性多關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、功能障礙甚至關(guān)節(jié)畸形為特點(diǎn)的慢性自身免疫性疾病，基本病理表現(xiàn)為慢性滑膜炎。研究認(rèn)為白介素17(Interleukin 17，IL-17)與RA的疾病進(jìn)程緊密相關(guān)[1]，它主要由輔助性T細(xì)胞17(T Helper 17 cell，Th17)分泌,而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)則通過調(diào)控核基因轉(zhuǎn)錄，控制著Th17的分化與成熟，并由此調(diào)控多種下游細(xì)胞因子如IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α等的表達(dá)[2]，最終形成STAT3-Th17正反饋通路，使炎癥信號(hào)逐漸放大。因此，針對(duì)STAT3的靶向調(diào)控，即可下調(diào)Th17的分化，有效控制RA的滑膜炎癥。松杖方是民間侗醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)方，用于臨床中取得較好療效[3-4]。本研究通過松杖方的兔含藥血清干預(yù)的方法，觀察對(duì)人RAFS中STAT3及相關(guān)蛋白孤核受體γt(Orphan nuclear receptor gammat，ROR-γt)、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3(Suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)的影響，探討松杖方的抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 滑膜細(xì)胞來源:滑膜組織取自貴州中醫(yī)藥大學(xué)(原貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院)第二附屬醫(yī)院骨科行關(guān)節(jié)置換術(shù)及我科行關(guān)節(jié)鏡診療術(shù)的RA患者，標(biāo)本的獲取均通過患者知情同意。RA 的診斷符合ACR1987 年分類標(biāo)準(zhǔn)或EULAR2010年分類標(biāo)準(zhǔn)，并除外合并有感染、腫瘤、其他風(fēng)濕病等情況，3個(gè)月內(nèi)未使用慢作用抗風(fēng)濕藥。

1.1.2 試劑及藥物:松杖方由松蘿、虎杖組成，兩藥各等分。雷公藤多苷(貴州漢方制藥有限公司)；來氟米特片(蘇州長(zhǎng)征-欣凱制藥有限公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(HyClone)；胰酶(HyClone)；胎牛血清(Gibico)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ROR-γt、SOCS-3及pSTAT3檢測(cè)試劑(英國(guó)ABCAM 公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Yeasen公司)。

1.1.3 儀器:恒溫培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-20AIC，日本)；高速離心機(jī)(Eppendorf，5810R，德國(guó))；顯微鏡(CKX-41，Olympus)；酶標(biāo)儀(BioTek，EL×800 V，美國(guó))。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及含藥血清制備:新西蘭大白兔36只(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄各半，SF級(jí)，體重(2.0±0.2)kg。隨機(jī)分為六組，每組6只，即空白組、松杖方高、中、低劑量組、來氟米特組和雷公藤多苷組。松杖方高、中、低劑量組分別灌服成人等效劑量9倍、6倍、3倍生藥量溶液，雷公藤多苷對(duì)照組及來氟米特對(duì)照組灌服成人等效劑量雷公藤多苷和來氟米特混懸液，每天1次，連續(xù)1周，于末次給藥2 h后無菌條件下心臟取血，分離血清，組內(nèi)血清混合，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定:充分分離RA滑膜組織，用PBS液清洗2遍，并剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，放置在無菌瓶?jī)?nèi)，經(jīng)胰酶消化、離心處理后，取細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5 %的CO2條件下培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，傳代至第3～5代，流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定。取3代生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)分組給予相應(yīng)含藥血清干預(yù)。

1.2.2 給藥劑量：根據(jù)人與兔體重?fù)Q算公式進(jìn)行計(jì)算，成人所需松杖方生藥量為1.05 g/kg，該劑量為低劑量，3倍為中劑量，9倍為高劑量，實(shí)驗(yàn)時(shí)以PBS液稀釋含藥血清成相應(yīng)濃度，取相應(yīng)藥量；雷公藤多苷2.1 mg/kg，來氟米特0.7 mg/kg。實(shí)驗(yàn)中直接給予相應(yīng)劑量含藥血清。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)RASF細(xì)胞增殖的影響:取3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RASF消化離心后，以10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至96孔板，細(xì)胞濃度約為5×104個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)分設(shè)空白組、來氟米特組、雷公藤多苷組、松杖方高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取相應(yīng)含藥血清加入每孔中干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收取細(xì)胞，按常規(guī)操作流式細(xì)胞儀檢測(cè)RAFS的凋亡情況。每組樣品檢測(cè)6次，采用FASCDiva軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)RASF細(xì)胞ROR-γt、SOCS-3和STAT3、pSTAT3蛋白表達(dá)水平的影響:將PBMC或滑膜細(xì)胞低溫勻漿后加蛋白裂解液，置冰上40 min，4 ℃12000 r/min離心10 min，取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford 法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h；一抗4 ℃過夜。用不含抗體TBS-T液孵育作為陰性對(duì)照。反復(fù)洗膜后，將膜與堿性磷酸酶(AP) 標(biāo)記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后，用免疫印跡觀察，用圖像分析測(cè)定各帶吸光度(A)值做定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察 滑膜組織培養(yǎng)3～5 d，鏡下呈梭形、多角形、星形等多種形態(tài)，細(xì)胞呈漩渦狀排列生長(zhǎng)，傳至3～5代后，RAFS生長(zhǎng)密集，形態(tài)趨向于梭形，大小均一，折光性強(qiáng)，呈平行樣或者漩渦狀排列增殖，增殖速度較快。隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒物質(zhì)，生長(zhǎng)緩慢，光亮度逐漸下降。本研究選擇3代細(xì)胞(圖1)。

圖1 滑膜細(xì)胞形態(tài)圖

2.2 松杖方含藥血清對(duì)RAFS凋亡的影響 檢測(cè)結(jié)果分析，各含藥血清干預(yù)組RAFS凋亡率與空白組比較均顯著升高(P<0.05)，松杖方含藥血清組細(xì)胞凋亡率與藥物濃度相關(guān)；松杖方中劑量組與雷公藤多苷組、來氟米特組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;松杖方高劑量組RAFS凋亡率最高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 松杖方含藥血清對(duì)RA滑膜細(xì)胞凋亡的影響(%)

2.3 松杖方含藥血清對(duì)RASF的ROR-γt、SOCS-3和pSTAT3蛋白表達(dá)水平的影響 與空白組比較，各含藥血清干預(yù)組RAFS中ROR-γt、pSTAT3的表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中松杖方高劑量組ROR-γt、pSTAT3的表達(dá)量最低，與雷公藤多苷組及來氟米特組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。而各含藥血清干預(yù)組RAFS中SOCS-3的表達(dá)量差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見表2(圖2)。

表2 松杖方含藥血清對(duì)RAFS的ROR-γt、SOCS-3、STAT3表達(dá)水平的影響

1.正常對(duì)照組；2.松杖方低劑量組；3.松杖方中劑量組；4.松杖方高劑量組；5.雷公藤多苷組；6.來氟米特組

3 討 論

RA是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥損傷為特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有多種細(xì)胞因子參與其發(fā)病過程，而STAT3介導(dǎo)的炎癥通路占據(jù)重要地位[5-6]。STAT3屬于一類胞漿蛋白家族，在體內(nèi)參與了多種炎癥因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并參與調(diào)控滑膜細(xì)胞、T細(xì)胞等的增殖、分化。當(dāng)IL-6、TGF-β與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后，使JAK活化并招募STAT3蛋白并使其磷酸化，pSTAT3蛋白具有生物活性，以二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄程序，表達(dá)ROR-γt，激活ROR-γt信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而介導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17分化[7-8]，導(dǎo)致大量炎癥因子生成并形成正反饋，進(jìn)一步活化STAT3。STAT3活化后同時(shí)具有調(diào)控RAFS的增殖、分化、凋亡以及釋放炎癥因子的能力[9-10]，細(xì)胞因子具有強(qiáng)大的致炎功能，可直接作用于關(guān)節(jié)滑膜組織，導(dǎo)致滑膜炎癥持續(xù)、血管翳形成。

ROR-γt是類固醇激素受體家族成員，是重要的介導(dǎo)炎癥因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，通過STAT3發(fā)揮作用。ROR-γt可以增強(qiáng)IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄，上調(diào)IL-17的水平[11-12]，繼而激活NF-κB通路并導(dǎo)致NF-κB相關(guān)炎癥因子如IL-1、IL-6、TNF-α等活性增強(qiáng)，促使多種炎癥因子協(xié)同作用[13],STAT3與細(xì)胞因子成相互促進(jìn)的作用，最終形成STAT3-ROR-γt -Th17-炎癥因子-滑膜炎的環(huán)形炎癥軸鏈。而SOCS-3則可以抑制STAT3活性。SOCS是一類新型的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白，其家族成員大都參與JAK-STAT信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，而SOCS-3是其中之一，具有較強(qiáng)的生物活性。一旦抑制了STAT3的活性、破壞了環(huán)形炎癥軸鏈，就可以阻止滑膜炎癥。

侗藥的“風(fēng)濕痛”與RA的臨床表現(xiàn)相符，該病因正氣不足、感受外邪，機(jī)體功能失調(diào)之后滋生內(nèi)熱，是發(fā)病的關(guān)鍵，故治療上在“趕邪”時(shí)，也清內(nèi)在“邪熱”。松杖方有松蘿、虎杖組成，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、清熱解毒、消腫理氣的功效，現(xiàn)代研究證實(shí)松蘿具有抑制炎癥、降低血清炎癥因子水平、抑制毛細(xì)血管生成等功效[14-15]，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)松杖方可抑制CIA大鼠NF-κB信號(hào)通路，減少IL-1、TNF-α的分泌[16-17]。本研究顯示中、高劑量的松杖方可下調(diào)pSTAT3的表達(dá)，各劑量組均可下調(diào)ROR-γt的表達(dá)，抑制強(qiáng)度與藥物劑量相關(guān)。說明松杖方可同時(shí)抑制ROR-γt、pSTAT3的基因表達(dá)，抑制炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)，促進(jìn)RAFS凋亡，阻斷RA炎癥持續(xù)發(fā)生。