閆士華， 謝子奇， 張露曉， 羅云敬

(北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100124)

展青霉素(Patulin，PAT)是常見的真菌毒素之一,其毒性極強(qiáng)且分布范圍廣[1]，在世界各地的多種食品中均不同程度檢測到PAT[2,3]，于霉變的水果中尤其常見，嚴(yán)重威脅著人們的健康。體外實(shí)驗(yàn)表明[4,5]，PAT可誘導(dǎo)多種菌株的基因突變，對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞亦有DNA損傷作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)PAT對(duì)多種器官有明顯的毒性[6,7]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2761-2017)《食品中真菌毒素限量》規(guī)定蘋果汁等食品中PAT限量為50 μg/kg[8]。由于PAT的高毒性，各國學(xué)者對(duì)其靈敏和準(zhǔn)確的檢測方法給予高度關(guān)注，但是PAT檢測仍然有一些問題存在：微乳液電動(dòng)色譜法準(zhǔn)確度較低[9]、酶聯(lián)免疫法操作繁瑣[10]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)成本高昂[11]等。高效液相色譜(HPLC)結(jié)合紫外法檢測食品中的PAT，因簡單且準(zhǔn)確于2016年納入中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[12]。然而，利用HPLC法檢測實(shí)際樣品中的PAT時(shí)，5-羥甲基糠醛(5-HMF)因結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)類似[13]，對(duì)其檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性造成影響，更何況實(shí)際樣品中組分較多，目標(biāo)分析物極易被干擾。

近年來，食品中PAT檢測樣品前處理方法主要有分散固相萃取法[14]、固相萃取法[15]、多功能凈化柱法[16]等。固相萃取法是較為常用的方法，但傳統(tǒng)的吸附材料無法對(duì)PAT進(jìn)行特異性捕捉，限制其應(yīng)用。呂偉超等[17]采用自制固相萃取柱聯(lián)用超高效液相色譜檢測PAT，色譜雜峰多。分子印跡聚合物(MIPs)技術(shù)與固相萃取(SPE)技術(shù)結(jié)合可望解決上述問題，這是基于MIPs有特定結(jié)構(gòu)的孔穴，能特異性結(jié)合目標(biāo)物分子，因而有很高的專一性與準(zhǔn)確度。本研究以PAT類似物2-吲哚酮為替代模板，采用本體聚合法合成了具有特異性的PAT-MIPs，并以此為填料制備了固相萃取小柱，聯(lián)用HPLC法分析了蘋果汁復(fù)雜基質(zhì)中的PAT含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

e2695型高效液相色譜，沃特世公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵，上海科升儀器有限公司。

展青霉素(PAT)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、2-吲哚酮(Oxin)、偶氮二異丁腈(AIBN)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，均購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；5-羥甲基糠醛(5-HMF，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；無水NaAc、乙酸乙酯、冰HAc(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 HPLC條件

色譜柱：SμnFireRM C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈∶HAc∶水=5∶0.5∶94.5(V/V/V)；等度洗脫；流速1 mL/min。柱溫30 ℃；檢測波長276 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3 PAT-MIPs的制備

準(zhǔn)確稱取0.6658 g替代模板Oxin溶解在25 mL的乙酸乙酯中，加入2.146 mL的功能單體4-VP。超聲15 min，常溫靜置孵育6 h。加入0.25 g引發(fā)劑AIBN和3.95 mL交聯(lián)劑EGDMA。超聲脫氣15 min，充入氮?dú)?5 min，60 ℃下水浴24 h。將所得的固體物質(zhì)研磨，過分子篩。然后以乙酸乙酯為提取劑索氏提取12 h，再以甲醇∶乙酸(9/1,V/V)混合液為提取劑索氏提取24 h，最后以甲醇作為提取劑在索氏提取器上洗脫12 h。最終將經(jīng)過索氏提取的固體物質(zhì)放入干燥箱中烘干24 h。非印跡聚合物(NIPs)的制備在合成步驟上與MIPs相同，但不加模板分子。

1.4 PAT-MIPs的靜態(tài)吸附試驗(yàn)

分別稱取5、10、20、30、40 mg的MIPs和NIPs于離心管中，加入1.5 mL的PAT標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 mg/L)。將離心管置于搖床上振蕩60 min，然后2 000 r/min高速離心3 min，過0.22 μm濾膜，利用HPLC法檢測上清液中PAT的濃度，計(jì)算聚合物靜態(tài)吸附百分比。

1.5 PAT-MIPs的吸附動(dòng)力學(xué)及印跡因子試驗(yàn)

分別稱取10 mg的MIPs和NIPs于離心管中，再加入1.5 mL的PAT標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 mg/L)。將離心管置于搖床上振蕩(時(shí)間范圍為0～60 min,梯度為15 min)，然后以2 000 r/min高速離心3 min，過 0.22 μm 濾膜，利用HPLC法檢測上清液中PAT的濃度，計(jì)算出各個(gè)樣品的吸附容量。根據(jù)飽和吸附容量計(jì)算聚合物的印跡因子(Imprinting Factor，IF)[18]。

1.6 分子印跡固相萃取小柱的制備

在5 mL聚丙烯固相萃取空柱中均勻填入200.0 mg制備的MIPs，分別在聚合物上下兩側(cè)加蓋聚乙烯篩板，填充均勻，用玻璃棒輕輕壓實(shí)，得到柱壓適當(dāng)?shù)姆肿佑≯E固相萃取(MISPE)小柱。

1.7 樣品前處理及MISPE過程

在10 mL離心管中精確移取1.5 mL蘋果汁樣品，加入100 μL的PAT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(200 mg/L)，再加入乙酸乙酯5 mL，混勻。超聲5 min，使蘋果汁中的PAT被完全萃取。靜置5 min，移取上清液于潔凈離心管中。在40 ℃條件下用氮?dú)獯蹈呻x心管中的乙酸乙酯，再加入5 mL乙酸鹽緩沖液復(fù)溶，以待后續(xù)凈化。

向MISPE小柱中按序加入3 mL甲醇和3 mL水進(jìn)行活化處理，再加入5 mL復(fù)溶的溶液上樣，最后加入3 mL去離子水淋洗。排凈小柱中的液體后，加入3 mL乙酸乙酯作為洗脫液洗脫柱中吸附的PAT。收集洗脫液，40 ℃氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，利用HPLC法檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備條件的優(yōu)化

2.1.1 模板分子的優(yōu)化控制其他條件不變，以PAT結(jié)構(gòu)類似物2-羥基煙酸(2-HNA)和Oxin為替代模板分子制備聚合物并比較其吸附性能。結(jié)果如圖1所示，以O(shè)xin為模板分子制備的MIPs吸附效果優(yōu)于2-HNA，因此選擇Oxin為替代模板。

2.1.2 反應(yīng)溶劑的優(yōu)化MIPs制備過程中，反應(yīng)溶劑的選擇不僅影響了聚合反應(yīng)的發(fā)生，也影響著MIPs的性能。控制其他條件不變，分別選用甲醇、乙酸乙酯和乙腈三種溶劑作為反應(yīng)溶劑制備MIPs，比較聚合物的吸附性能。不同溶劑制備的MIPs吸附性能排序依次為：乙酸乙酯>甲醇>乙腈。乙酸乙酯作為反應(yīng)溶劑時(shí)制備的MIPs對(duì)PAT吸附容量可達(dá)630 μg/g，顯著高于其他溶劑(P<0.05)，且乙酸乙酯安全性最好，因此選擇乙酸乙酯作為反應(yīng)溶劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 功能單體的優(yōu)化分別以APTES、4-VP、MAA及AM作為功能單體制備PAT-MIPs，將制得的聚合物作為吸附劑，用PAT標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行平衡吸附實(shí)驗(yàn)得到各個(gè)樣品的吸附容量，以APTES和4-VP為功能單體制作的聚合物吸附性更好，兩者差異不大(P>0.05)。再用PAT和5-HMF的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測定各個(gè)樣品中PAT與5-HMF相對(duì)分配系數(shù),結(jié)果如圖2所示。4-VP制作的聚合物選擇性更好，選擇性對(duì)預(yù)處理樣品中PAT的富集和高效檢測有重要的影響，因此最終選擇4-VP作為功能單體。

圖1 模板分子的優(yōu)化Fig.1 Optimization of template molecules

圖2 功能單體選擇性的比較Fig.2 Comparison of the selectivity of functional monomers

2.2 聚合物掃描電子顯微鏡(SEM)表征

圖3為PAT-MIPs(a)及NIPs(b)的掃描電鏡(SEM)圖?？梢钥闯鯬AT-MIPs表面較為粗糙，形成了特定的疏松孔穴結(jié)構(gòu)，說明模板分子已洗脫，存在的孔穴能夠與目標(biāo)分子相匹配，而NIPs仍較為光滑，結(jié)構(gòu)緊實(shí)，沒有能與目標(biāo)分子結(jié)合的位點(diǎn)。

圖3 PAT-MIPs(a)和PAT-NIPs(b)的掃描電鏡(SEM)圖(放大倍數(shù)為×20.0 K)Fig.3 SEM images of PAT-MIPs(a) and PAT-NIPs(b)(Magnification of ×20.0 K)

2.3 色譜條件的選擇

5-HMF通常被認(rèn)為是PAT檢測中的主要干擾物。按照1.2 HPLC條件測定PAT和5-HMF的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 mg/L)，考察其分離情況。結(jié)果如圖4所示，PAT及5-HMF分離度良好，它們的保留時(shí)間分別為3.25 min和3.57 min。

2.4 聚合物靜態(tài)吸附分析

由圖5可知，隨著加入的MIPs和NIPs的質(zhì)量增加，MIPs和NIPs對(duì)于溶液中PAT的吸附百分比逐漸增大；但MIPs的吸附百分比始終大于NIPs，當(dāng)投入的聚合物質(zhì)量達(dá)到40 mg時(shí)，MIPs的吸附百分比(58.70%)近似于NIPs吸附百分比(18.85%)的三倍，這證明了MIPs中具有與目標(biāo)物PAT相匹配的孔穴結(jié)構(gòu)，使MIPs能夠表現(xiàn)出優(yōu)于NIPs的吸附性能。

2.5 吸附動(dòng)力學(xué)及印跡因子

聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖6所示，振蕩前45 min，MIPs對(duì)于PAT的吸附容量隨著時(shí)間的增加而增大，且MIPs相比NIPs有更高的吸附速率。振蕩45 min時(shí)MIPs吸附容量為898.0 μg/g達(dá)到最高點(diǎn)，之后趨平，因此45 min為飽和吸附時(shí)間，并以此為條件進(jìn)行IF的計(jì)算。

由表1可知，飽和吸附條件下MIPs吸附目標(biāo)物質(zhì)PAT的性能達(dá)到NIPs的3.114倍，表明MIPs對(duì)于PAT具有特異性吸附的能力。

圖6 MIPs和NIPs的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 Adsorption kinetics curve of MIPs and NIPs

表1 MIPs與NIPs的吸附性能比較Table 1 Comparison of the adsorption properties of MIPs and NIPs

2.6 實(shí)際樣品中PAT殘留的測定

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限配制PAT濃度分別為0、1、5、10、20、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)合MISPE-HPLC測得PAT液相色譜圖,線性方程為:y=53 616x-17 562(y為PAT峰面積，x為PAT濃度(mg/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992)。在0～50 mg/L范圍內(nèi)，PAT的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。測定低濃度PAT標(biāo)準(zhǔn)溶液并計(jì)算信噪比(S/N)，以信噪比為3確定的方法檢測限為3 μg/L。方法的精密度(RSD)為1.92%。

圖7 未處理的蘋果汁加標(biāo)樣品(a)、蘋果汁加標(biāo)樣品乙酸乙酯提取(b)、蘋果汁加標(biāo)樣品經(jīng)乙酸乙酯提取及MISPE小柱凈化(c)、蘋果汁未加標(biāo)經(jīng)乙酸乙酯提取及MISPE小柱凈化后(d)色譜圖Fig.7 Chromatograms of untreated spiked apple juice sample(a),spiked apple juice sample after ethyl acetate extraction(b),spiked apple juice sample after ethyl acetate extraction and MISPE column cartridge purification(c),and unspiked apple juice sample after ethyl acetate extraction and MISPE column cartridge purification(d)

2.6.2 蘋果汁中PAT殘留的檢測對(duì)蘋果汁樣品進(jìn)行HPLC法檢測，樣品分別為：未處理的蘋果汁加標(biāo)樣品(圖7a)、蘋果汁加標(biāo)經(jīng)乙酸乙酯提取樣品(圖7b)、蘋果汁加標(biāo)經(jīng)乙酸乙酯提取及MISPE小柱凈化后樣品(圖7c)和蘋果汁未加標(biāo)經(jīng)乙酸乙酯提取及MISPE小柱凈化后樣品(圖7d)。未處理的蘋果汁加標(biāo)樣品存在十余種雜質(zhì)峰，且基線不平，化學(xué)結(jié)構(gòu)與PAT極其相似的5-HMF雜峰峰面積高。經(jīng)乙酸乙酯提取后雜質(zhì)峰減少，但5-HMF仍有較高峰面積，為提取前93.2%。再經(jīng)MISPE小柱凈化后基線平整，5-HMF峰明顯降低，濃度僅為未經(jīng)處理前13.70%，PAT回收率為89.3%，未加標(biāo)的空白對(duì)照樣品基線平穩(wěn)，未檢出PAT。結(jié)果表明樣品經(jīng)過MISPE小柱凈化處理后，樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的殘留量得到了有效控制，該方法有效凈化了樣品基質(zhì)中的非目標(biāo)物雜質(zhì)，有效實(shí)現(xiàn)PAT選擇性分離。

2.6.3 加標(biāo)回收率取蘋果汁樣品，分別添加50、100、200 μL的PAT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(200 mg/L)，按照1.7方法處理，HPLC法測定，每個(gè)水平重復(fù)4次，結(jié)果見表2。PAT回收率在78.2%～90.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在5%以內(nèi)，表明PAT-MIPs萃取結(jié)合HPLC法能夠有效地檢測蘋果汁中的PAT含量。

表2 蘋果汁中PAT的加標(biāo)回收率(n=4)Table 2 Recoveries of PAT spiked in apple juice samples(n=4)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功制備了具有特異吸附性的PAT分子印跡聚合物，并以此為填料制備了固相萃取柱，結(jié)合HPLC法檢測了蘋果汁中PAT的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該方法能有效降低蘋果汁復(fù)雜食品基質(zhì)中的5-羥甲基糠醛等干擾物干擾，可以消除十余種雜質(zhì)峰，回收率達(dá)到78.2%～90.1%，選擇性好，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可為PAT引起的食品安全檢測提供有力的支撐。