王 晗， 趙曉亞， 葉 誠(chéng)， 尚吟竹， 周 艷， 車志彥， 陳新艷， 鄭茜玥， 譚 杰， 吳建安， 王 鵬*

(武漢海關(guān)，湖北武漢 430050)

圖1 羥甲烯龍的化學(xué)式Fig.1 The chemical formula of oxymetholone

羥甲烯龍是一種合成代謝類雄激素，羥甲烯龍的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。該藥物能夠作為口服類固醇被動(dòng)物吸收[1,2]，可以用于貧血和HIV相關(guān)的肌肉萎縮癥的治療。羥甲烯龍其在動(dòng)物體內(nèi)不僅能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)異化，還能降低血膽固醇、減少鈣磷排泄、促進(jìn)發(fā)育、組織新生和肉芽形成。因此，它可能被非法用于動(dòng)物的育種和養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，并殘留在動(dòng)物源性食品中。對(duì)于運(yùn)動(dòng)員這一特殊人群，羥甲烯龍是“國(guó)際反興奮劑組織”(WADA)明確禁用的蛋白同化制劑[3]，日常飲食中攝入含有羥甲烯龍的食品極有可能造成興奮劑陽(yáng)性檢出[4 - 6]。對(duì)于普通消費(fèi)者，羥甲烯龍的攝入則會(huì)造成肝臟及心血管損傷、引發(fā)睪丸癌及精神障礙等疾病[4,7]。基于此，必須建立針對(duì)畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的有效檢測(cè)方法。

羥甲烯龍的檢測(cè)手段包括氣相色譜-質(zhì)譜法[8]和液相色譜-串聯(lián)/質(zhì)譜法。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相較于氣相色譜-質(zhì)譜法的靈敏度更高、選擇性也較好，因此被廣泛應(yīng)用于合成代謝類雄激素的檢測(cè)之中[9 - 13]。但由于畜禽產(chǎn)品基質(zhì)差異較大，而羥甲烯龍?jiān)谑称分械臍埩袅枯^低，因此目前文獻(xiàn)中的檢測(cè)方法往往僅適合于單一基質(zhì)，而建立通用于多種畜禽產(chǎn)品的檢測(cè)方法具有一定的難度。本工作擬采用基于液相萃取的前處理手段，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用，建立適合于多種畜禽產(chǎn)品基質(zhì)中羥甲烯龍檢測(cè)的分析方法，用于畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的食品安全監(jiān)督檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 6500型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB SCIEX,USA)；2-16PK型低溫離心機(jī)(Sigma,Germany)；MS2型漩渦混合儀(IKA,Germany)；TurboVap LV型氮吹儀(Biotage,Sweden)；MS型分析天平(Mettler Toledo Instruments Co.,Ltd.,China)。

羥甲烯龍標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)溶液：稱取羥甲烯龍標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃下避光保存，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1%甲酸-甲醇溶液逐級(jí)稀釋至所需濃度。β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶(β-葡萄糖醛酸酶活力>100 000 U/mL，芳基硫酸酯酶活力<20 000 U/mL)購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司。甲醇、甲酸、乙醚、HAc均為色譜純?cè)噭?LiChrosolv,Merck,Germany)，其他試劑為分析純。NaAc-HAc緩沖液：稱取13.6 g NaAc，溶解于500 mL水中，用適量HAc調(diào)節(jié)pH至5.2，該緩沖溶液用于動(dòng)物源性樣品的酶解。

1.2 樣品制備

豬肉、牛肉、羊肉(約500 g)放入組織搗碎機(jī)均質(zhì)，充分混勻，備用。新鮮雞蛋取16枚(約1 kg)，洗凈去殼后充分混勻，備用。牛奶從冰箱中取出，放置至室溫，搖勻，備用。

稱取5.0000 g試樣置于50 mL離心管中，加入10 mL NaAc溶液，25 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，于溫度37 ℃條件下水浴振蕩2 h。向離心管中加入約1.5 mL飽和Na2CO3溶液使混合溶液的pH為10，加入20 mL乙醚，5 g NaCl和2 g無(wú)水MgSO4，劇烈搖晃后渦旋混勻1 min，振蕩提取30 min，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速在-4 ℃下離心10 min，取出后繼續(xù)放入-20 ℃冰箱中冷凍至水相凝固，取上層乙醚于50 mL離心管中，氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 色譜及質(zhì)譜檢測(cè)條件

色譜柱：XSELECT HSS T3柱(100 mm×3.0 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序如下：0.00～1.00 min，保持流動(dòng)相A為70%；1.00～2.00 min，流動(dòng)相A由70%變?yōu)?0%；2.00～3.00 min，保持流動(dòng)相A為30%；3.00～4.00 min，流動(dòng)相A由30%變?yōu)?%；4.00～8.00 min，保持流動(dòng)相A為5%，流動(dòng)相B為95%；8.00～8.10 min，流動(dòng)相A由5%變?yōu)?0%；8.10～10.00 min，保持流動(dòng)相A為70%。柱溫：30 ℃，流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣量：5 μL。

離子源為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子掃描，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮?dú)饧捌渌m合氣體。電噴霧電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，氣簾氣壓力241 kPa，霧化氣壓力413 kPa，輔助氣壓力344 kPa。羥甲烯龍的定量離子對(duì)為m/z333.0/99.0，監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z333.0/159.2，去簇電壓140 V，碰撞能量分別為40 eV和30 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜檢測(cè)條件優(yōu)化

羥甲烯龍質(zhì)譜檢測(cè)條件在Manual Tuning模式下進(jìn)行優(yōu)化。將1.0 mg/L羥甲烯龍溶液以7 μL/min的速度泵入質(zhì)譜儀中，在Q1 MS模式下尋找母離子，發(fā)現(xiàn)其為m/z333.0；之后對(duì)去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化，選擇為140 V；在Product Ion模式下尋找子離子，發(fā)現(xiàn)其子離子包括m/z99.0和159.2，其中m/z99.0強(qiáng)度更高，確定其為定量子離子；在MRM模式下對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，確定離子對(duì)為m/z333.0/99.0和333.0/159.2的碰撞能量分別為40 eV和30 eV。

2.2 液相分離條件優(yōu)化

采用MRM模式的LC-MS/MS法進(jìn)行分析時(shí)，必須盡可能的防止流動(dòng)相中共流出物對(duì)待測(cè)組分的離子抑制作用。本工作比較了XSELECT HSS T3色譜柱、CAPCELL PAK C18 MG色譜柱、ZORBAX SB-C18色譜柱對(duì)羥甲烯龍的保留情況。結(jié)果表明，在Waters XSELECT HSS T3色譜柱上羥甲烯龍的保留時(shí)間適中、峰形更加尖銳對(duì)稱，且與樣品基質(zhì)峰能徹底分離。因此，在后續(xù)檢測(cè)中采用該色譜柱進(jìn)行分離檢測(cè)。

羥甲烯龍的色譜檢測(cè)條件的優(yōu)化，采用混合畜禽產(chǎn)品基質(zhì)提取液加標(biāo)至100 ng/mL作為模擬樣品，以監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z333.0/99.0和333.0/159.2的色譜分離情況為標(biāo)準(zhǔn)，考察不同流動(dòng)相條件下羥甲烯龍與基質(zhì)峰分離情況，確定了1.3中的色譜分離條件。

2.3 樣品提取條件的選擇

羥甲烯龍?jiān)趧?dòng)物體內(nèi)會(huì)發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合和硫酸鹽結(jié)合反應(yīng)[1]，因此畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的測(cè)定需要先進(jìn)行酶解。本工作使用商品化的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶試劑進(jìn)行酶解[1]。稱取5.0000 g樣品，加入10 mL NaAc-HAc緩沖溶液，渦旋混勻后，加入25 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，再渦旋混和，于37 ℃水浴2 h。

在提取條件的優(yōu)化中，采用混合基質(zhì)樣品進(jìn)行條件考察，將豬肉、牛肉、羊肉、雞蛋和牛奶樣品進(jìn)行等分(m/m)混合。

2.3.1 pH的選擇羥甲烯龍的logP值為4.4，pKa為4.5，是具有一定極性的酸性物質(zhì)，因此考慮采用合適的有機(jī)溶劑在堿性條件下對(duì)其進(jìn)行萃取。本工作以Na2CO3-NaHCO3緩沖體系為基礎(chǔ)，考察了pH在7～12范圍內(nèi)，羥甲烯龍?jiān)诓煌琾H條件下的提取效果，結(jié)果如圖2中所示。結(jié)果表明，羥甲烯龍的提取效率隨著pH的升高而上升，pH=9時(shí)基本達(dá)到平臺(tái)，因此選擇pH=10作為提取的pH。

2.3.2 提取溶劑及體積的選擇實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚作為提取劑對(duì)羥甲烯龍?zhí)崛⌒实挠绊憽＝Y(jié)果如圖3中所示，乙醚的提取效率最佳，且在離心分離過(guò)程中，水相及有機(jī)相分層最為清晰，而二氯甲烷盡管提取效率近似于乙醚，但由于其密度大于水，因此在離心后位于離心管下層，不利于有機(jī)相與樣品的分離。因此，實(shí)驗(yàn)采用乙醚為提取溶劑。

考察了5、10、15、20、25和30 mL乙醚用量下羥甲烯龍的提取效果，結(jié)果表明，隨著提取劑使用量的增加，羥甲烯龍的提取效率有所增加，但到15 mL后就不再上升，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用20 mL乙醚作為提取溶劑。

圖2 不同pH條件對(duì)羥甲烯龍的提取影響Fig.2 Effect of pH on the extraction of oxymetholone

圖3 不同提取溶劑對(duì)羥甲烯龍的提取影響Fig.3 Effect of extraction solvent on the extraction of oxymetholone

2.3.3 凈化方式考察考慮到畜禽產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，本工作嘗試采用QuEChERS法中常用的吸附劑乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)及石墨化炭黑(GCB)對(duì)提取液進(jìn)行凈化，結(jié)果表明三種吸附劑均對(duì)有機(jī)提取液中的羥甲烯龍有一定的吸附作用。

隨后考察了固相萃取(SPE)凈化的可行性，對(duì)HLB(3 cc/60 mg)和C18(3 mL/100 mg)兩種SPE小柱進(jìn)行考察。采用HLB和C18小柱對(duì)3 mL乙醚提取液進(jìn)行凈化，1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)洗脫的情況下，HLB對(duì)提取液中羥甲烯龍的吸附率為16.2%，C18對(duì)提取液中羥甲烯龍的吸附率為17.1%，HLB洗脫后的最終的萃取效率為10.5%，C18洗脫后的最終的萃取效率為10.9%；溶劑置換后采用極性更大的甲醇重溶上樣予以考察，1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)洗脫，該條件下HLB對(duì)提取液中羥甲烯龍的吸附率為37.7%，C18對(duì)提取液中羥甲烯龍的吸附率為42.5%，HLB洗脫后的最終的萃取效率為31.8%，C18洗脫后最終的萃取效率為34.9%，因此采用SPE雖然能在一定程度上對(duì)樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化，但無(wú)法滿足對(duì)提取液中羥甲烯龍定量萃取的要求。通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)條件的優(yōu)化，各基質(zhì)加標(biāo)樣品的提取液直接氮吹重溶后，色譜圖中不會(huì)出現(xiàn)明顯的干擾峰。因此本工作最終采用液相萃取、氮吹重溶后直接LC-MS/MS檢測(cè)的方法進(jìn)行羥甲烯龍的分析。

2.4 分析性能考察

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)方法的分析性能進(jìn)行了考察，檢出限(羥甲烯龍響應(yīng)值為噪聲3倍時(shí)的濃度)為0.02 mg/kg，定量限(10倍信噪比)為0.05 mg/kg，線性范圍為0.05～1.0 mg/kg，方法精密度為10.1%(n=7)，線性關(guān)系如表1中所示。不同基質(zhì)中羥甲烯龍加標(biāo)檢出限濃度的色譜圖如圖4中所示。

目前，羥甲烯龍?jiān)谑称分猩袩o(wú)限量要求，而WADA對(duì)運(yùn)動(dòng)員尿樣檢測(cè)方法的檢出限為5 ng/mL[3]，考慮到羥甲烯龍隨食物在進(jìn)入人體后的吸收及排泄有限，本方法可以滿足畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的日常檢測(cè)安全監(jiān)督。

表1 不同樣品中羥甲烯龍的線性關(guān)系Table 1 The linear relationship of oxymetholone in different samples

圖4 不同樣品中羥甲烯龍檢出限濃度的色譜圖Fig.4 Chromatograms of oxymetholone(0.02 mg/kg) in different samples

2.5 實(shí)際樣品分析

將本方法應(yīng)用于市售的豬肉、牛肉、羊肉、牛奶及雞蛋樣品中羥甲烯龍的分析，在5種實(shí)際樣品中均未檢出羥甲烯龍。因此，采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性。由表2中結(jié)果可知，在不同樣品中羥甲烯龍的回收率在80.2%～110.0%之間，表明本方法準(zhǔn)確性良好，可用于多種動(dòng)物源性基質(zhì)中羥甲烯龍的分析檢測(cè)。

表2 不同樣品中羥甲烯龍的加標(biāo)回收率(n=7)Table 2 Recoveries of oxymetholone in different samples(n=7)

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3 結(jié)論

本工作建立了適用于多種畜禽產(chǎn)品基質(zhì)中蛋白同化制劑羥甲烯龍的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法的建立填補(bǔ)了目前國(guó)家及各行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中蛋白同化制劑羥甲烯龍的檢測(cè)空白，有助于運(yùn)動(dòng)員食品中食源性興奮劑檢測(cè)工作的推進(jìn)和滿足食品安全監(jiān)督檢測(cè)需求。