郭宣利, 王文廉*

(1.中北大學(xué)儀器科學(xué)與動態(tài)測試教育部重點實驗室，山西太原 030051； 2.中北大學(xué)電子測試技術(shù)國家重點實驗室，山西太原 030051)

甲硝唑(MNZ)是臨床常用的硝基咪唑類抗生素藥物，具有抗菌和消炎的作用[1]，由于MNZ具有生長促進劑的作用，可以促進水產(chǎn)品的的生長，致使在水產(chǎn)品飼料中添加時有發(fā)生，對人體健康造成危害[2]。當前檢測MNZ的方法如色譜法[3]、質(zhì)譜法[4]和紫外分光光度法[5]存在操作繁瑣，時間冗長，成本太高等問題。分子印跡技術(shù)是指制備對某一特定目標分子具有特異選擇性聚合物的過程。在分子識別、固相萃取、色譜分離等方面得到廣泛應(yīng)用。分子印跡傳感器具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點，便于自動化和現(xiàn)場檢測使用，檢測成本低，已成為研究熱點[6,7]。

目前，分子印跡聚合物(MIPs)的制備方法主要有本體聚合、懸浮聚合、沉淀聚合等[8]。金屬納米顆粒,諸如Au、Pt、Ag、Cu、Ni,已經(jīng)成為最熱門的增加電化學(xué)活性的電催化劑[9,10]。Au納米粒子(Au NPs)與Cu納米粒子(Cu NPs)較大的比表面積可以有效增加分子的負載量，且可與生物分子良好兼容，用它作為增敏材料可有效提高電化學(xué)傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性以及生物相容性[11]。與單一的納米粒子相比，納米合金粒子的催化特性和生物相容性更加突出，不同納米粒子雖然相互獨立，但納米合金卻不只是兩種納米粒子性能的簡單相加。而是在保持各個金屬特點的基礎(chǔ)上，具有金屬間協(xié)同作用產(chǎn)生的綜合性能[15]。本文采用電沉積法將Au-Cu合金納米粒子(AuCu NPs)修飾在玻碳電極表面，利用循壞伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)對所修飾的MNZ分子印跡傳感器進行電化學(xué)表征。結(jié)果顯示納米Au-Cu修飾的電極信號更靈敏。通過多次實驗優(yōu)化了實驗條件，實現(xiàn)了對MNZ的測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；三電極體系(北京眾信恒通科技有限公司)：4 mm玻碳電極(GCE)為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt網(wǎng)電極為對電極；WS70-1紅外干燥箱(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SY360超聲清洗儀(上海寧商超聲儀器有限公司)。

甲硝唑(MNZ)、羅硝唑、4-硝基咪唑均購于上海晶純試劑有限公司，上述三種物質(zhì)均用甲醇溶解后用于后續(xù)實驗。鄰苯二胺購于Adamas中國(上海)有限公司；HAuCl4、CuSO4購于國藥上海化學(xué)試劑公司。所用試劑均為分析純，所有溶液都由高純水配制。

甲硝唑片(每片含甲硝唑0.2 g)在當?shù)厮幍曩徺I。

1.2 實驗方法

1.2.1 AuCu NPs/GCE的制備將GCE在鹿皮上，分別用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末拋光至光亮的鏡面后，在超聲波清洗儀中分別用HNO3(1+1)、無水乙醇和高純水超聲清洗3 min,清洗好的電極在5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中掃描，直到獲得穩(wěn)定的CV曲線。將電極用氮氣吹干后備用。將干燥潔凈的電極置于10 mmol/L HAuCl4、5 mmol/L CuSO4與0.5 mol/L H2SO4的混合溶液中進行恒電流沉積。沉積電流為-0.6 mA，沉積時間為900 s，沉積過程中用磁子不斷攪拌。隨后，在烘箱中烘干，即制得AuCu NPs/GCE。

1.2.2 AuCu NPs/MNZ/GCE的制備將AuCu NPs/GCE放入含0.2 mol/L MNZ和0.4 mol/L鄰苯二胺的混合溶液中，在0～0.8 V電位范圍內(nèi)采用CV法，在掃速50 mV/s下掃描40圈進行電聚合，隨著掃描的進行，電極表面會鍍上一層弱電性MNZ分子印跡聚合物膜，電聚合完成后將電極置于0.3 mol/L的H2SO4溶液中，在100 mV/s的掃速下，于-1～1 V電位范圍內(nèi)用CV法掃描進行洗脫，直到在4.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl的混合溶液進行掃描至氧化還原峰且峰值大小不變，說明MNZ已經(jīng)從分子印跡膜中洗脫下來。用氮氣吹干，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuCuNPS/GCE的電化學(xué)表征

圖1為AuCu NPs/GCE的電化學(xué)表征，由于CV曲線峰值電流差距過大，放在同一圖中難以分辨最小峰電流的曲線，我們將表征分為A圖和B圖。圖1A為裸GCE與修飾Au NPs后的電極在K3[Fe(CN)6] 溶液中的CV曲線，圖1B為鍍Au NPs與鍍AuCu NPs的電極在K3[Fe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安曲線。由圖1A可知，Au NPs可以在一定范圍內(nèi)增加傳感器的響應(yīng)電流值。由圖1B電流大小可知，納米合金相比于單一的納米粒子電流響應(yīng)更大，因此傳感器的靈敏度更高。圖1中鍍Au NPs電極的制備與制備AuCu NPs電極類似，只是將10 mmol/L HAuCl4、5 mmol/L CuSO4與0.5 mol/L H2SO4的混合溶液中的CuSO4去掉，其余制備方法均相同。

圖1 不同電極在5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms curves of different electrodes in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] solution A:Bare electrode (a) and electrode after plating nano-gold (b);B:Electrode after plating nano-gold (b) and nano-gold-copper alloy(c).

2.2 MNZ甲硝唑在AuCu NPS/GCE上的電化學(xué)行為

將制備好的AuCu NPs/MNZ/GCE放入1.0×10-9mol/L的MNZ溶液中孵育10 min后，放入5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中進行DPV掃描，記錄其峰值電流。探討MNZ在修飾電極上的電化學(xué)行為，原理是洗脫后帶有MNZ分子空穴的分子印跡膜在孵育后被MNZ分子占據(jù)，使得電極表面的有效電子轉(zhuǎn)移數(shù)目減少，所以電流會減小。通過實驗得到結(jié)論，MNZ未孵育時和孵育后在裸GCE上的電流相比雖有減小，但減小很微弱，與AuCu NPs/GCE修飾電極相比出現(xiàn)了明顯減小的峰值。這可能是因為AuCu NPs/GCE具有良好的導(dǎo)電性、較高的比表面、良好的穩(wěn)定性，使電極對MNZ的檢測更靈敏，所以與裸電極相比，AuCu NPs/GCE修飾電極占據(jù)MNZ空穴能力更強，使得電流減小更加明顯。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 電沉積電流的優(yōu)化采用DPV法研究了GCE在-0.8～0.3 mA恒電流下沉積AuCu NPs的效果。結(jié)果表明，在-0.6～-0.3 mA范圍內(nèi)峰電流隨沉積電流的增加而增大；當沉積電流達到-0.6 mA時，峰電流達到最大，說明沉積效果最好。

2.3.2 電沉積時間的優(yōu)化采用DPV法研究了GCE修飾AuCu NPs在200～1 200 s之間的效果，得到結(jié)果在200～900 s峰電流隨著沉積時間的增加而增大，超過900 s后，峰電流隨著時間增加而減小，說明900 s時電沉積已經(jīng)達到飽和。

2.3.3 模板分子與功能單體比例的優(yōu)化改變模板分子和功能單體比例并對DPV法的峰電流進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當模板分子與功能單體比例低于1∶2時，響應(yīng)電流隨著比例增加而增大，當模板分子與功能單體比例高于1∶2時，響應(yīng)電流開始減小。原因可能是模板分子數(shù)量變少，功能單體過多，過多的功能單體占據(jù)了電極表面，導(dǎo)致形成的分子印跡膜太厚，洗脫不完全，所以結(jié)合位點減少，響應(yīng)電流下降。

2.3.4 電聚合圈數(shù)的優(yōu)化在電聚合時可以通過控制聚合圈數(shù)來控制分子印跡膜的厚度，實驗結(jié)果表明，當電聚合圈數(shù)少于40圈時，聚合圈數(shù)和響應(yīng)電流成正比，當電聚合圈數(shù)大于40圈時，響應(yīng)電流開始減少。原因可能是聚合膜厚度增加，模板分子很難洗脫完全，所以響應(yīng)電流下降。

2.3.5 洗脫液和洗脫液濃度的優(yōu)化在電極表面電聚合分子印跡聚合物之后，必須進行洗脫實驗，才能得到具有模板分子空穴的分子印跡傳感器。因此，適當?shù)南疵搫┦浅晒χ频梅肿佑≯E膜的關(guān)鍵?？晒┻x擇的洗脫劑，包括NaOH、H2SO4、磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7)和KCl。對這些洗脫劑我們逐一進行了實驗，記錄他們的DPV響應(yīng)電流，結(jié)果表明H2SO4具有最佳的洗脫效果(圖2A)。此外，我們對H2SO4的濃度也進行了優(yōu)化(圖2B)，由圖我們可以看出，在0.1～0.3 mol/L范圍內(nèi)，電流響應(yīng)峰值逐漸變大，當H2SO4濃度高于0.3 mol/L時，電流響應(yīng)開始下降，所以，最佳的洗脫劑是濃度為0.3 mol/L的H2SO4溶液。

圖2 AuCu NPs/MNZ/GCE的DPV峰電流與洗脫劑種類(A)和洗脫劑濃度(B)關(guān)系曲線Fig.2 Curves of the DPV peak current of AuCu NPs/MNZ/GCE as a function of the eluent species(A) and eluent concentration(B)

圖3 AuCu NPs/MNZ/GCE的DPV峰電流與洗脫圈數(shù)關(guān)系曲線Fig.3 Curve of DPV peak current as a function of the elution cycles of AuCu NPs/MNZ/GCE

2.3.6 洗脫時間的優(yōu)化由圖3中可以看出，洗脫圈數(shù)在15～30圈時，響應(yīng)電流隨著洗脫圈數(shù)增加而增大，但洗脫圈數(shù)繼續(xù)增加時，響應(yīng)電流就會減小。這可能是由于洗脫過度，分子印跡膜被破壞導(dǎo)致電流降低。

2.4 標準曲線與檢出限

在優(yōu)化后的實驗條件下，將AuCu NPs/GCE置于不同濃度MNZ溶液中孵育10 min后，放入4.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中進行DPV掃描，記錄峰值電流，結(jié)果如圖4(A)所示。隨著MNZ濃度增大，DPV響應(yīng)電流減小，并且DPV響應(yīng)在4.0×10-10～8.0×10-7mol/L濃度范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系(圖4(B))，線性方程為：IP=-3.85119lgc-24.70427(IP：10-5A，c:mol/L)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.99438。當信噪比(S/N)為3時，檢出限為3.25×10-12mol/L。

圖4 (A)分子印跡電化學(xué)傳感器在不同濃度的MNZ溶液中孵育10 min后的DPV曲線；(B)MNZ濃度與峰電流的關(guān)系擬合曲線Fig.4 (A)DPV curves of molecularly imprinted electrochemical sensor after incubation for 10 min in different concentrations of MNZ solution(a:4.0×10-10,b:4.0×10-9,c:8.0×10-9,d:4.0×10-8,e:8.0×10-8,f:4.0×10-7,g:8.0×10-7 mol/L);(B)Fitting curve of relationship between MNZ concentration and peak current

將制得的傳感器與已知的其他檢測MNZ的傳感器進行比。由表1可以看出，與其他檢測MNZ的電極相比，AuCu NPs/MNZ/GCE具有更寬的線性范圍和更低的檢出限，可以看出納米合金復(fù)合物與其他單一修飾材料相比更有優(yōu)勢。

表1 AuCu NPs/MNZ/GCE電極與已報道其他電極檢測MNZ的比較Table 1 Comparison of AuCu NPs/MNZ/GCE with other electrodes reported for MNZ

圖5 (A)AuCu NPs/MNZ/GCE在不同溶液中的DPV曲線；(B)AuCu NPs/MNZ/GCE在連續(xù)5 d的DPV峰電流曲線Fig.5 (A) DPV curves of AuCu NPs/MNZ/GCE in different solutions(a:blank solution,b:4-nitroimidazole,c:ronidazole;d:dimetridazole,e:metronidazole)；(B) Peak current of DPV of AuCu NPs/MNZ/GCE for five consecutive days

2.5 識別特異性和重復(fù)性

用制得的MIPs/AuCu NPs分子印跡傳感器檢測與MNZ結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)(羅硝唑、4-硝基咪唑、二甲基咪唑)來確定所制備傳感器的識別性。如圖5(A)所示，曲線a為洗脫后未經(jīng)孵育電極的DPV響應(yīng)曲線，曲線b～e分別為在4-硝基咪唑、羅硝唑、二甲基咪唑和MNZ的溶液中孵育10 min后的DPV響應(yīng)曲線。檢測原理與前面提到的檢測MNZ在修飾電極上的電化學(xué)行為原理相同，與未孵育電極相比電流響應(yīng)差值越大，識別性越好。從圖中可以看出，與未孵育相比，傳感器在MNZ溶液中孵育10 min，峰值電流差值Δ1遠大于其他差值Δ2、Δ3、Δ4，這說明MNZ可以被傳感器的空穴很好地識別，而將傳感器放入其他三種溶液中，峰值電流幾乎不發(fā)生變化，表明制得的傳感器有良好的識別性。

用制得的傳感器連續(xù)5 d利用DPV法掃描測定相同濃度的MNZ，得到圖5(B)，結(jié)果電流響應(yīng)沒有明顯的變化，相對標準偏差(RSD)<3%，說明所制備的傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

圖6 AuCu NPs/MNZ/GCE在1.0×10-9 mol/L的MNZ中(a)和1.0×10-9 mol/L的MNZ與1.0×10-7 mol/L的其他物質(zhì)混合后的溶液中(b)的DPV曲線Fig.6 DPV curve of AuCu NPs/MNZ/GCE in 1.0×10-9 mol/L MNZ(a) and 1.0×10-9 mol/L MNZ mixed with 1.0×10-7 mol/L other substances(b)

2.6 抗干擾性

采用AuCu NPs/GCE進一步考察在實際樣品中主要干擾物質(zhì)的電流響應(yīng)，來探究所制備傳感器的抗干擾能力。由于我們選用的實際樣品(甲硝唑片)中淀粉、葡萄糖、蔗糖和MNZ為主要共存物質(zhì)，因此配制1.0×10-9mol/L MNZ溶液，加入100倍濃度的淀粉、葡萄糖、蔗糖混合后進行DPV掃描，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，與單獨檢測MNZ溶液(a)相比，混合溶液(b)電流響應(yīng)幾乎沒有改變。說明AuCu NPs/GCE在實際樣品檢測中有良好的抗干擾能力。

2.7 實際樣品分析

以甲硝唑片(每片含0.2 g甲硝唑)作為樣品，考察制備的傳感器實際可用性。取10片樣品研磨后用pH=6.6的PBS逐步稀釋成50 mL濃度為2.0×10-9mol/L的樣品溶液，之后分別取10 mL樣品溶液加入一定量的MNZ標準溶液進行加標回收率測定，結(jié)果如表2。經(jīng)計算，回收率為96%～107%。表明該分子印跡傳感器具有良好的實際樣品檢測能力，可以對復(fù)雜樣品中的甲硝唑進行定量分析。

表2 實際樣品中甲硝唑回收率測定結(jié)果Table 2 Recovery of metronidazole in actual samples

3 結(jié)論

通過電沉積在電極表面修飾了Au-Cu納米合金，制備了能夠特異性識別甲硝唑的分子印跡電化學(xué)傳感器，與裸電極進行比較，修飾Au-Cu納米的傳感器具有明顯的電催化作用。該傳感器具有良好的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明該方法可以應(yīng)用于實際樣品中甲硝唑的測定。