王娜 李旻 王靜 李偉蘭 劉汝利 張?jiān)倥d 周尚清 郭霞

目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為梅尼埃病的主要病理基礎(chǔ)是內(nèi)耳積水，表現(xiàn)為眩暈、感音神經(jīng)性聾、耳鳴、耳悶脹感[1]。隨著梅尼埃病發(fā)病率的升高，其病因引起研究者們的高度重視。有研究發(fā)現(xiàn)梅尼埃病的發(fā)生可能與一些蛋白和基因相關(guān)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1((monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)是一類特異性分泌蛋白，國內(nèi)曾就其在肝、腎和細(xì)菌感染等疾病方面進(jìn)行探索[2]，在耳部疾病方面的研究甚少。最近國外學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCP-1和CC家族趨化因子在耳蝸外側(cè)壁血管紋及螺旋韌帶等部位有表達(dá)，所以推測這些因素可能誘導(dǎo)內(nèi)耳部分病變的產(chǎn)生[3]。脂蛋白(a)[LP(a)]主要由肝臟合成，呈球形顆粒狀，是具有毒性的新型脂蛋白[4,5]。近來研究表明高脂蛋白血癥和動(dòng)脈硬化是聽力下降和毛細(xì)胞病變的危險(xiǎn)因素[6,7]。LP(a)升高及微循環(huán)病變也可能引起迷路組織結(jié)構(gòu)的病變，從而引起或促使聽力減退[8]。故本實(shí)驗(yàn)借助膜迷路積水大鼠模型研究MCP-1和LP(a)在大鼠耳蝸及血液中的表達(dá)變化，分析兩者與梅尼埃病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)SD大鼠30只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，雌雄不限，3～6月齡，體重170～200 g，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、正常組，每組10只。納入標(biāo)準(zhǔn)：耳廓反射敏銳，鼓膜正常，前庭功能正常。

1.2膜迷路積水動(dòng)物模型制作 實(shí)驗(yàn)組大鼠給予醋酸去氨加壓(DDAVP)腹腔注射，起始劑量4 μg·kg-1·d-1，連續(xù)注射7 d后調(diào)整劑量為6 μg·kg-1·d-1，連續(xù)注射3 d[9]。對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。正常組不作任何處理。停藥7 d后三組大鼠進(jìn)行ABR檢測。耳蝸取材后，通過中階橫截面積/(中階+前庭階橫截面積)比值[SM/(SM+SV)]評(píng)價(jià)膜迷路積水造模情況，如大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、步態(tài)蹣跚等癥狀，ABR檢測聽功能下降、SM/(SM+SV)>1/3提示造模成功。

1.3ABR檢測 大鼠深度麻醉后將地極、記錄電極和參考電極分別插入相應(yīng)位置，刺激聲為短聲(click)，在距外耳道孔約1.0 cm處給予聲源刺激，每間隔0.1 ms反復(fù)給予刺激，刺激頻率為100～2 000 Hz，記錄持續(xù)時(shí)間10 ms，疊加1 024次，記錄各組大鼠波Ⅱ的閾值以及60 dB nHL聲刺激時(shí)波Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ的潛伏期及Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅴ波間期變化。

1.4采血及耳蝸取材 大鼠麻醉成功后，仰臥位固定；暴露腹主動(dòng)脈采血，將備用血置于EP管內(nèi)-20 ℃保存；固定液固定大鼠：剖開右心房，先后用0.9%NACL溶液及固定液灌流沖洗固定；固定液固定耳蝸：在顯微鏡下將取出之耳蝸反復(fù)灌流固定；浸洗、脫鈣；梯度酒精脫水；常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.5SM/(SM+SV)比值評(píng)價(jià)膜迷路積水 統(tǒng)計(jì)大鼠中階面積(SM)、中階加前庭階面積(SM+SV)，將各組SM/SM+SV的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6免疫組織染色檢測MCP-1在大鼠耳蝸的表達(dá) ①耳蝸標(biāo)本脫蠟、水化：切片置于二甲苯中浸泡10 min；無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇中各浸泡5 min；3% H2O2滴加在切片上，室溫靜置10 min；PBS洗2～3次，每次各5 min；②抗原修復(fù)：抗原修復(fù)溶液(pH 8.0)高壓修復(fù)3 min。③H2O2孵育15 min，滴加封閉液20 min。滴加一抗50 μl，4 ℃過夜。次日滴加二抗40～50 μl(中杉金橋，HPV-9001)，孵育1 h；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10 min；脫水、透明、封片，運(yùn)用顯微成像系統(tǒng)采集各組圖像觀察分析。MCP-1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。

1.7酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測LP(a)水平 把待測血清從-20 ℃移至-4 ℃中消融，準(zhǔn)備LP(a)的試劑盒，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔備用，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品加樣，溫育箱內(nèi)孵育，配置濃縮洗滌液，洗滌液洗滌，加酶標(biāo)試劑 ，顯色劑顯色，終止液終止，酶標(biāo)儀檢測OD值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ABR檢測結(jié)果 由表1可見，實(shí)驗(yàn)組大鼠ABR波Ⅱ閾值升高、波Ⅱ、Ⅴ潛伏期及Ⅲ-Ⅴ波間期較正常組和對(duì)照組均延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠ABR檢測結(jié)果

2.2各組大鼠SM/(SM+SV)比值結(jié)果 由表2可見，實(shí)驗(yàn)組SM/(SM+SV)比值大于1/3，且顯著大于正常組和對(duì)照組，提示膜迷路積水造模成功。

表2 各組大鼠SM與SM+SV及SM/(SM+SV)結(jié)果

2.3MCP-1在各組大鼠耳蝸組織的表達(dá) 由圖1可見，MCP-1在正常組及對(duì)照組耳蝸螺旋器、血管紋螺旋韌帶及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞組織中均無表達(dá)，而在實(shí)驗(yàn)組的上述組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中表達(dá)明顯，前庭膜上也有表達(dá)。

圖1 MCP-1在三組大鼠耳蝸的表達(dá)(免疫組化×100)

2.5LP(a)水平與SM/(SM+SV)面積比值、ABR各指標(biāo)的相關(guān)性分析 由表3可見，LP(a)水平與SM/(SM+SV)面積比值及ABR波Ⅱ閾值、波Ⅱ、Ⅴ潛伏期及Ⅲ-Ⅴ波間期之間均存在明顯的正相關(guān)(P<0.05)。

表3 LP(a)水平與SM/(SM+SV)面積比值、ABR波Ⅱ閾值、波Ⅱ、Ⅴ潛伏期及Ⅲ-Ⅴ波間期的相關(guān)性分析

3 討論

梅尼埃病病因不明確，目前研究可能與內(nèi)淋巴吸收障礙、內(nèi)淋巴生成過多、內(nèi)分泌紊亂、免疫反應(yīng)、自主神經(jīng)功能紊亂、炎癥等因素有關(guān)[10]。趨化因子可以操縱細(xì)胞按特定方向移動(dòng)，其受體主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表面[11]。MCP-1的滲出功能與感染有關(guān)，它在激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、纖維等細(xì)胞時(shí)滲出，單核炎癥細(xì)胞體表有融合力很高的MCP-1受體，耳蝸組織中的單核細(xì)胞被激發(fā)后可以分泌MCP-1，誘發(fā)感染，導(dǎo)致聽力減退。研究者發(fā)現(xiàn)MCP-1誘導(dǎo)感染因子IL-1、IL-6等在迷路病變中發(fā)揮作用，而梅尼埃病的發(fā)生與IL-1有一定關(guān)聯(lián)[12]。MCP-1在迷路病變中的表達(dá)是通過IL-10/Hmox1途徑來調(diào)控的，學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)人迷路的免疫系統(tǒng)有乳鐵蛋白、Toll樣受體(TLR)等基因調(diào)控[13]，而Moon等[14]發(fā)現(xiàn)MCP-1在迷路病變中的作用是螺旋韌帶細(xì)胞通過TLR2介導(dǎo)的NF-κB激活上調(diào)引起的。梅尼埃病的發(fā)生比較復(fù)雜，可能與多種因素有關(guān)，通過上述研究發(fā)現(xiàn)MCP-1介導(dǎo)迷路病變，推測MCP-1可能與梅尼埃病的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)性。

關(guān)于LP(a)在梅尼埃病的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，學(xué)者推測有以下兩種可能[15]：①LP(a)是同時(shí)含有糖-載脂蛋白(a)的特殊物質(zhì)，血液中的纖溶酶原(PGN)與其存在相似特性，通過減少纖維蛋白原的產(chǎn)生，促進(jìn)內(nèi)耳血管內(nèi)皮下脂質(zhì)堆積硬化，隨著病情進(jìn)一步進(jìn)展促使血管痙攣使得血管內(nèi)血栓形成，導(dǎo)致內(nèi)耳神經(jīng)缺血變性，引起相應(yīng)臨床表現(xiàn)。②通過注射DDAVP建立膜迷路積水動(dòng)物模型，DDAVP對(duì)LP(a)有一定的影響：其一，DDAVP加速血友病因子Ⅷ的激活，同時(shí)促使釋放組織PGN激活物；其二，DDAVP與迷路血管內(nèi)皮上的受體結(jié)合，使內(nèi)皮細(xì)胞間的距離增大，LP(a)等物質(zhì)通過縫隙滲入內(nèi)皮內(nèi)膜下，參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成[16,17]。以上兩種因素使得LP(a)水平升高，借助介導(dǎo)迷路血管內(nèi)脂代謝和纖溶機(jī)制，使內(nèi)耳血管痙攣或血栓形成，導(dǎo)致迷路血流量減少，引起感音神經(jīng)性聾、耳脹滿感及前庭功能異常。內(nèi)耳對(duì)缺血改變很敏感，內(nèi)耳血管血流減少后會(huì)導(dǎo)致螺旋器、壺腹嵴、囊斑的功能障礙，進(jìn)而出現(xiàn)梅尼埃病一系列臨床表現(xiàn)[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射DDAVP建立膜迷路積水動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)組中階面積(SM)與中階加前庭階面積(SM+SV)的比值大于1/3，而正常組和對(duì)照組SM與SM+SV基本等于1/3，提示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物造模成功；ABR檢測顯示波Ⅱ閾值升高，波Ⅱ、Ⅴ潛伏期及Ⅲ-Ⅴ波間期延長，提示膜迷路積水可以引起大鼠聽功能下降；MCP-1在實(shí)驗(yàn)組耳蝸螺旋器、血管紋螺旋韌帶及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞組織中表達(dá)明顯，前庭膜上也有表達(dá)，說明MCP-1可能與梅尼埃病之間存在關(guān)聯(lián)，其作用機(jī)理可能是MCP-1趨化吸引靶細(xì)胞從而誘發(fā)膜迷路積水，進(jìn)而導(dǎo)致梅尼埃病的發(fā)生。目前LP(a)水平在膜迷路積水動(dòng)物模型中有無變化尚無相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測三組大鼠的LP(a)水平變化，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠LP(a)水平升高。將三組LP(a)水平與膜迷路積水程度及ABR各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示LP(a)水平與膜迷路積水程度及ABR各指標(biāo)均呈明顯正相關(guān)，提示LP(a)水平升高，與膜迷路積水的形成及聽力下降可能存在一定關(guān)系，其可能參與梅尼埃病的發(fā)生。

但具體MCP-1及LP(a)如何在梅尼埃病中調(diào)控引起病變有待進(jìn)一步探討。后續(xù)通過實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究MCP-1及LP(a)在梅尼埃病發(fā)生中的作用機(jī)理，為梅尼埃病的診斷及治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，開辟新思路。