宋宜澤 趙孟麗 郝志云 羅玉柱 劉 秀 李少斌 沈繼源 柯 娜 王繼卿

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院/甘肅省草食動物生物技術重點實驗室/甘肅省牛羊基因改良工程實驗室，蘭州 730070)

山羊絨纖維由次級毛囊產(chǎn)生，被稱為“軟黃金”[1-2]。羊絨纖維主要由角蛋白(Keratins，Ks)和角蛋白相關蛋白(Keiatin associated proteins，KAPs)構成[3]，這2種蛋白的重量占羊絨纖維重量的90%以上。Ks組裝成角蛋白中間絲(Keratin intermediate filaments, KIFs)蛋白，構成了羊絨纖維骨架，KAPs通過二硫鍵填充于KIFs周圍[4]。KAPs最顯著的特征是含有豐富的半胱氨酸(Cysteine，Cys)、或者甘氨酸(Glycine，Gly)和酪氨酸(Tyrosine，Tyr)[5]。根據(jù)氨基酸的組成和含量，KAPs可以分為3大類，分別是：高甘氨酸/酪氨酸KAPs(HGT-KAPs，含有35～60 mol%的Gly/Tyr)、高硫KAPs(HS-KAPs, 含有≤30 mol%的Cys)和超高硫KAPs(UHS-KAPs, 含有>30 mol%的Cys)[6]。根據(jù)序列相似性，KAPs可被進一步劃分為不同的家族。例如，KAP6～8、KAP18～22和KAP36同屬于HGT-KAPs[7-8]。

KAP蛋白的編碼基因標識為KRTAPs，其長度較小，一般只包含1個單獨的外顯子[9]。研究表明，KRTAPs基因的核苷酸序列變異與山羊的羊絨性狀密切相關。例如，Wang等[7]在隴東絨山羊上發(fā)現(xiàn)，KRTAP20-1等位基因A的存在與較大的絨層高度和產(chǎn)絨量相關(P<0.05)，等位基因B的存在與較小的產(chǎn)絨量和平均纖維直徑的相關(P<0.05)；Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)KRTAP15-1等位基因A能顯著降低隴東絨山羊的平均纖維直徑(P=0.006)；Wang等[20]發(fā)現(xiàn)KRTAP20-2等位基因A的存在與隴東絨山羊較大的產(chǎn)絨量相關(P<0.001)，而等位基因B的存在與較小的產(chǎn)絨量相關(P<0.01)。

KRTAP36家族只包含KRTAP36-1基因一個成員。在綿羊上已發(fā)現(xiàn)，KRTAP36-1基因位于綿羊的1號染色體上，在新西蘭羅姆尼羊等3個群體中共檢測到3個等位基因和4個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)。相關性分析表明，等位基因A的存在與較大的產(chǎn)絨量相關(P=0.035)，等位基因C的存在與較大的平均纖維直徑相關(P=0.025)[8]。目前有關KRTAPs基因的研究主要集中在人類和綿羊上。例如，在人類基因組中，共鑒定出來自25個家族的80多個KRTAPs基因[10-11]；在綿羊基因組中，共發(fā)現(xiàn)來自13個家族的29個KRTAPs基因。但在山羊基因組中目前只發(fā)現(xiàn)來自12個基因家族的15個KRTAPs，包括KRTAP1-1[12]、KRTAP1-4[13]、KRTAP6-2[14]、KRTAP7-1[15]、KRTAP8-1[16]、KRTAP8-2[15]、KRTAP9-2[17]、KRTAP11-1[18]、KRTAP13-1、KRTAP13-3[12]、KRTAP15-1[19]、KRTAP20-1[7]、KRTAP20-2[20]、KRTAP24-1[21]和KRTAP28-1[22]。因為KRTAPs基因序列具有種間保守性，說明山羊基因組上還有大量的KRTAPs基因有待進一步鑒定。

子午嶺黑山羊是我國一個歷史悠久的地方品種，以盛產(chǎn)黑猾皮和紫絨著稱，毛黑而光亮，有優(yōu)美的波浪形卷曲，花穗美觀，羊絨纖維細，是高檔紡織原料。因此，本試驗以子午嶺黑山羊為研究對象，采用生物信息學和比較基因組學方法，在山羊基因組中鑒別出KRTAP36-1基因。采用已廣泛應用于KRTAPs基因研究的單鏈構象多態(tài)性(Single strand conformation polymorphism，SSCP)分析和測序法，檢測該基因的SNPs。最后分析該基因的核苷酸序列變異對子午嶺黑山羊羊絨性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在甘肅省環(huán)縣鈺生絨山羊繁育有限公司，選擇11只無親緣關系的子午嶺黑山羊種公羊，采用人工授精技術對子午嶺黑山羊母羊進行配種。在出生的后代羔羊中，隨機選擇342只健康無病和生長發(fā)育正常的子午嶺黑山羊作為研究對象。當這些羔羊生長至12月齡時，現(xiàn)場測定產(chǎn)絨量，背中線處測定絨層高度。同時在背中線處采集山羊絨樣本，用于實驗室測定羊絨細度。對于測定了羊絨性狀的所有子午嶺黑山羊，頸靜脈采血8 mL，加入酸性檸檬酸葡萄糖(Acid-citrate-dextrose，ACD)抗凝，用苯酚-氯仿法提取血液基因組DNA。

1.2 引物設計與PCR反應

以綿羊KRTAP36-1基因的編碼區(qū)序列(GenBank登錄號：MK770620)作為模板，用GenBank的BLAST功能，在山羊基因組GCF_001704415.1(www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001704415.1)中進行同源性搜索。在搜索結果中，與綿羊KRTAP36-1序列相似性最高的山羊序列被假定為子午嶺黑山羊的KRTAP36-1基因。據(jù)此序列，設計特異性引物(上游引物：5′-GGTTTACCACACCCACAATG-3′，下游引物：5′-GTAGCATAGCAAGAGTGAAG-3′)，擴增367 bp的山羊假定的KRTAP36-1基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

采用20 μL反應體系進行PCR擴增，包括：10 μL Taq預混酶，0.25 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，0.8 μL DNA模板和7.6 μL去離子水。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸9 min；4 ℃低溫保存。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果。

1.3 PCR-SSCP檢測

在1 μL PCR擴增產(chǎn)物中加入9 μL變性緩沖劑(0.025%溴酚藍、98%去離子甲酰胺、0.025%二甲苯氰和10 mmol/L EDTA)?；旌衔镌?05 ℃變性 9 min 后立即放入冰水混合物中，上樣于16×18 cm、12%(Acr∶Bis=37.5∶1)的聚丙烯酰胺凝膠中，在0.5×TBE、6 ℃(恒溫)、350V電壓下電泳18 h。電泳結束后，根據(jù)Byun等[23]描述的方法對聚丙烯酰胺凝膠進行銀染顯色。

1.4 核苷酸序列測定及相關性分析

核苷酸序列測定方法因純合子和雜合子而異。若個體的基因型是純合子，直接對PCR擴增產(chǎn)物測序；若個體全部為雜合子(無純合子個體)，則根據(jù)Gong等[24]建立的方法切膠測序。序列測定在北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行。使用MEGA(V.5.0)進行序列比對和分析，并用最大簡約法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進化樹的置信度以1000次自展分析進行重復檢驗。

采用SPSS(V.20.0)軟件的一般線性混合效應模型(General liner mixed-effect models，GLMMs)，分析KRTAP36-1核苷酸序列狀態(tài)(存在或缺失)和基因型對子午嶺黑山羊3個羊絨性狀(產(chǎn)絨量、羊絨平均纖維直徑和絨層高度)的影響。為確定建模因素，分析了性別、父本(配種公羊)和出生等級(單羔和雙羔)對子午嶺黑山羊羊絨性狀的影響。結果表明，性別和父本對羊絨性狀有極顯著影響(P<0.01)，出生等級(單羔和雙羔)對羊絨性狀沒有顯著影響(P>0.05)。因此在GLMMs模型中，將核苷酸序列(或基因型)和性別作為固定效應，父本作為隨機效應。由于所有的子午嶺黑山羊均飼養(yǎng)于同一條件，且都在周歲時測定羊絨性狀，因此在模型中沒有考慮環(huán)境和年齡因素。具體模型如下：

核苷酸序列對羊絨性狀影響的研究模型：

Y=μ+Variant+Gender+Sire+e

(1)

基因型對羊絨性狀影響的研究模型：

Y=μ+Genotype+Gender+Sire+e

(2)

其中，Y為羊絨性狀表型值，μ為群體均值，Variant為核苷酸序列狀態(tài)(用0和1分別表示缺失和存在)，Genotype為基因型，Gender為性別，Sire為父本(配種公羊)，e為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 子午嶺黑山羊KRTAP36-1基因鑒定

以綿羊KRTAP36-1基因的編碼區(qū)序列(GenBank登錄號：MK770620)作為模板，應用BLAST程序在山羊基因組GCF_001704415.1中進行同源性搜索。結果顯示，在山羊1號染色體上發(fā)現(xiàn)了一個174 bp(nt3675662-nt3675835)的開放閱讀框，這個片段與綿羊KRTAP36-1基因的編碼區(qū)序列有98.28%的同源性。該片段周圍分布有已經(jīng)鑒定出的11個山羊KRTAPs基因，它們分別是KRTAP11-1、KRTAP7-1、KRTAP8-1、KRTAP8-2、KRTAP6-2、KRTAP20-2、KRTAP20-1、KRTAP15-1、KRTAP13-1、KRTAP13-3和KRTAP24-1。

經(jīng)PCR-SSCP分析，在342只子午嶺黑山羊中，共檢測到A、B和C3條核苷酸變異序列(圖2)，組成AA、BB、AB和AC4種基因型。

圖2 子午嶺黑山羊KRTAP36-1基因的PCR-SSCP檢測

基于人類、綿羊和山羊中已鑒別的所有HGT-KAPs的氨基酸序列，以及本研究獲得的3條山羊序列，構建了系統(tǒng)進化樹。結果顯示，這3條序列與綿羊的KAP36-1首先聚為一支，顯示出了最高的序列相似性。這表明本研究發(fā)現(xiàn)的3條序列來自于山羊KRTAP36-1基因。

豎線表示KRTAPs基因的位置，箭頭表示基因的轉錄方向，豎條下面的數(shù)字代表KRTAPs基因的名稱(如36-1代表KRTAP36-1)。

2.2 子午嶺黑山羊KRTAP36-1基因的核苷酸序列變異

測序結果表明，子午嶺黑山羊KRTAP36-1基因的3條核苷酸序列中存在2個SNPs，其中一個SNP(c.-18T/C)位于KRTAP36-1基因的5′UTR區(qū)域。另一個SNP(c.119A/G)為錯義突變，導致第40位的酪氨酸變?yōu)榘腚装彼?p.Tyr40Cys)。

2.3 山羊KAP36-1蛋白的氨基酸組成

山羊KRTAP36-1的3條核苷酸序列都編碼一條由57個氨基酸殘基組成的多肽鏈。這些多肽鏈含有高含量的Gly(36.84 mol%)和Tyr(26.32～28.07 mol%)，也含有中等含量的Ser(12.28 mol%)以及較低含量的Leu(8.77 mol%)、Phe(7.02 mol%)、Arg(3.51 mol%)、Pro(1.75 mol%)、Met(1.75 mol%)和Cys(0～1.75 mol%)。值得注意的是，在核苷酸序列A和B翻譯生成的多肽鏈中均不含Cys，只在核苷酸序列C翻譯生成的多肽鏈中發(fā)現(xiàn)了一個Cys殘基。

2.4 子午嶺黑山羊KRTAP36-1的基因型頻率和核苷酸序列頻率

在342只子午嶺黑山羊中，核苷酸序列A、B和C的頻率分別為68.13%、31.73%和0.15%?；蛐虯A、BB、AB和AC的頻率分別為40.06%、3.80%、55.85%和0.29%。

2.5 KRTAP36-1基因的核苷酸序列變異對子午嶺黑山羊羊絨性狀的影響

在子午嶺黑山羊上發(fā)現(xiàn)的3條核苷酸序列中，由于序列C的頻率低于5%，故將此序列排除在核苷酸存在/缺失模式之外。結果表明，核苷酸序列A的存在與較小的產(chǎn)絨量相關(P<0.001)，B的存在與較大的產(chǎn)絨量相關(P=0.004)。A和B的存在(或缺失)對羊絨平均纖維直徑和絨層高度無影響(P>0.05)(表1)。

表1 KRTAP36-1核苷酸序列變異與子午嶺黑山羊羊絨性狀間的相關性

對于AA、AB和BB3種優(yōu)勢基因型，分析了基因型對子午嶺黑山羊羊絨性狀的影響。結果發(fā)現(xiàn)，基因型影響了山羊的產(chǎn)絨量。BB型山羊的產(chǎn)絨量極顯著高于AB和AA型山羊(P<0.001)(表2)。

表2 KRTAP36-1基因型與子午嶺黑山羊羊絨性狀間的相關性

3 討 論

本研究從子午嶺黑山羊基因組中鑒定出了一個編碼HGT-KAP蛋白的KRTAP36-1基因，并分析了該基因的遺傳變異及其與子午嶺黑山羊羊絨性狀的相關性。山羊KRTAP36-1基因分布于1號染色體上，位于KRTAP20-1與KRTAP15-1之間，這與KRTAP36-1基因在綿羊染色體上的位置一致[8]。在山羊、綿羊和人類已鑒定的所有HGT-KAP序列中，山羊的KRTAP36-1序列與綿羊的KRTAP36-1序列有最高的同源性，可達97%。

人類、綿羊和山羊的KAPs序列分別用“h”、“s”和“g” 表示。本研究鑒定的山羊KAP36-1序列用方框顯示。山羊、綿羊和人類HGT-KAPs的GenBank登陸號為：NM 001193399(sKAP6-1)，KT725832(sKAP6-2)，KT725837(sKAP6-3)，KT725840(sKAP6-4)，KT725845(sKAP6-5)，X05639(sKAP8-1)，KF220646(sKAP8-2)，MH243552(sKAP 20-1)，MH071391(sKAP 20-2)KX377616(sKAP 22-1)，MK770620(sKAP36-1)，NM 181602(hKAP 6-1)，NM 181604(hKAP 6-2)，NM 181605(hKAP 6-3)，AJ457063(hKAP 7-1)，AJ457064(hKAP8-1)，AJ457067(hKAP19-1)，NM 181608(hKAP19-2)，NM 181609(hKAP19-3)，NM 181610(hKAP19-4)，NM 181611(hKAP19-5)，NM 181612(hKAP19-6)，NM 181614(hKAP19-7)，AB096964(hKAP19-8)，NM 181615(hKAP 20-1)，NM 181616(hKAP 20-2)，NM 181619(hKAP 21-1)，NM 181617(hKAP 21-2)，NM 181620(hKAP 22-1)，AY510121(gKAP7-1)，AY510122(gKAP8-1)，AY510123(gKAP8-2)，MG742218(gKAP20-1)，MF973462(gKAP20-2)。

引物序列用橫線標示，“-”表示與gKRTAP36-1*A的序列相同，大寫字母表示KRTAP36-1的編碼區(qū)序列，小寫字母表示非編碼區(qū)序列，2個SNPs顯示在序列上方(包括1個錯義突變)，起始密碼子ATG和終止密碼子TGA用方框顯示，SNPs的順序和書寫格式遵循了HGVS的命名規(guī)則(http:∥varnomen.hgvs.org/)。

在山羊KAP36-1中發(fā)現(xiàn)了高比例的Gly和Tyr(Gly含量為36.84 mol%，Tyr含量為26.32～28.07 mol%)，這符合HGT-KAPs蛋白質(zhì)含有35～60 mol%的Gly/Tyr這一特征。在山羊中，目前已研究了KAP6家族、KAP7-1、KAP8-1、KAP8-2、KAP20-1和KAP20-2這些HGT-KAPs蛋白的氨基酸組成。與以上HGT-KAPs蛋白相比，山羊KAP36-1中Gly+Tyr的含量與KAP6家族[25]、KAP20-1[7]和KAP20-2[20]接近，但顯著高于KAP7-1的34.52%、KAP8-1的40.30 mol%和KAP8-2的46.78 mol%[25]。研究發(fā)現(xiàn)，Gly和Tyr在HGT-KAP的結構和性質(zhì)中發(fā)揮了重要作用。Gly是20種氨基酸中側鏈最小的氨基酸，它可以影響KAP螺旋結構的形成，最終影響KAP和KIFs的交互作用[22]。Tyr是包含苯環(huán)結構的芳香族氨基酸，它可以通過π的交互作用調(diào)節(jié)KIFs的排列，最終影響羊絨纖維的結構[7]。通過以上Gly+Tyr含量比較結果表明，不同的HGT-KAPs蛋白，含有不同含量的Gly+Tyr，這也意味著這些HGT-KAPs蛋白在羊絨纖維形成過程和理化性質(zhì)中發(fā)揮了各自不同的作用。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)山羊KAP36-1蛋白含有極少量的Cys(0～1.75 mol%)，這遠遠低于山羊KAP20-1的7.94～9.52 mol%[7]、KAP20-2的14.52 mol%[20]，也低于KAP7-1的5.95 mol%和KAP8-1的6.50 mol%[25]。Cys是羊絨和羊毛纖維合成的第一限制性氨基酸，它形成了KAPs和KIFs之間交聯(lián)的二硫鍵。山羊KAP36-1中只有極少量的Cys，這表明KAPs和KIFs之間還存在其它形式的交聯(lián)作用。本研究在山羊KRTAP36-1核苷酸序列A和B編碼的多肽鏈中未發(fā)現(xiàn)Cys，在C編碼的多肽鏈中發(fā)現(xiàn)了一個Cys，這與綿羊KRTAP36-1的研究結果一致。Gong等在綿羊KRTAP36-1中共發(fā)現(xiàn)了3個等位基因，這3個等位基因編碼的多肽鏈中均沒有Cys。

本研究在山羊KRTAP36-1基因中發(fā)現(xiàn)了2個SNPs，少于綿羊上發(fā)現(xiàn)的4個SNPs[8]，這可能與所用的試驗群體有關。本研究的試驗對象是342只純種的子午嶺黑山羊，而綿羊KRTAP36-1研究中使用了46只新西蘭羅姆尼羊、48只美利奴羊和321只美利奴羊X無角短毛羊的雜種后代。這表明，如果以后的研究中使用更多的山羊品種，有可能在山羊KRTAP36-1基因上發(fā)現(xiàn)更多的核苷酸序列和SNPs。本研究在子午嶺黑山羊上發(fā)現(xiàn)的2個SNPs中，其中一個位于5′UTR區(qū)域，另一個為非同義突變，這與綿羊KRTAP36-1中發(fā)現(xiàn)的SNPs類型一致。Gong等[8]在綿羊KRTAP36-1中發(fā)現(xiàn)了1個5′UTR區(qū)域的SNP和3個非同義突變SNPs。表明這2個物種中KRTAP36-1基因的多態(tài)性有可能產(chǎn)生于同一種機制。但是在本研究中并未發(fā)現(xiàn)綿羊KRTAP36-1中的SNPs。

在本研究子午嶺黑山羊中發(fā)現(xiàn)的2個SNPs中，c.119A/G導致了多肽鏈上的第40位Tyr變?yōu)镃ys，鑒于Tyr和Cys在羊絨纖維中的重要作用，山羊KRTAP36-1基因的這個SNP有可能對羊絨纖維性狀有重要的影響。然而，由于本研究中選用的342只子午嶺黑山羊中，這個SNP產(chǎn)生的核苷酸序列C的頻率僅為0.15%，故無法通過相關性分析研究這種影響。建議將來在其他山羊品種和更多的山羊樣本中，進一步研究c.119A/G對山羊羊絨性狀的影響。另外一個SNP(c.-18T/C)處于非編碼區(qū)，雖然不能導致編碼氨基酸的改變，但它的功能同樣不能被忽視。因為這個SNP有可能與KRTAP36-1基因重要區(qū)域的其它SNPs連鎖，也有可能影響基因的轉錄結合位點、轉錄效率和mRNA的穩(wěn)定性，最終導致基因的功能發(fā)生變化[22]。序列比對發(fā)現(xiàn)，c.-18T/C導致了核苷酸序列B與A和C之間的序列差異，結合核苷酸序列B影響了產(chǎn)絨量這一相關性分析結果，說明c.-18T/C這個SNP影響了羊絨纖維的結構和性質(zhì)。

在山羊1號染色體上分布的12個KRTAPs基因中，前人已在相同試驗群體中研究了KRTAP15-1、KRTAP20-1、KRTAP20-2和KRTAP24-1對產(chǎn)絨量、羊絨纖維直徑和絨層高度這3個性狀的影響。結果發(fā)現(xiàn)，KRTAP15-1和KRTAP24-1影響了羊絨纖維直徑[19,21]，KRTAP20-1和KRTAP20-2影響了產(chǎn)絨量和絨層高度[7,20]。本研究中發(fā)現(xiàn)同樣位于1號染色體的KRTAP36-1基因影響了產(chǎn)絨量。在山羊1號染色體上，與KRTAP36-1基因距離最近的是KRTAP20-1基因，它們之間的距離約為50 kb，而KRTAP20-1基因的核苷酸序列變異也影響了山羊的產(chǎn)絨量(P<0.001)。由此推斷，KRTAP36-1基因?qū)ι窖虍a(chǎn)絨量的影響有可能是與KRTAP20-1基因相連鎖的結果。

相關性分析結果表明，核苷酸序列A的存在與較小的產(chǎn)絨量相關，B的存在與較大的產(chǎn)絨量相關。在342只子午嶺黑山羊中，核苷酸序列A和B的頻率分別為68.13%和31.73%。這表明在本試驗群體中，對產(chǎn)絨量這一性狀的人工選擇并不強烈。因此，在以后的育種過程中，應該有意識地選留含有序列B的個體，淘汰含有序列A的個體，以提高子午嶺黑山羊的產(chǎn)絨量。除了以上描述的KRTAPs基因以外，Qiao等[26]用全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)AKT1、ALX4、HK1和NT-3等基因參與了毛囊發(fā)育，與絨山羊細度有關。Li等[27]用全基因組重測序發(fā)現(xiàn)FGF5、SGK3、IGFBP7、OXTR和ROCK1基因與絨長、產(chǎn)絨量等絨山羊的羊絨性狀有關。

4 結 論

本研究首次在山羊1號染色體上鑒定出KRTAP36-1基因，在342只子午嶺黑山羊的該基因中檢測到3條變異核苷酸序列和2個SNPs。相關性分析表明，KRTAP36-1的核苷酸序列變異和基因型顯著影響了子午嶺黑山羊的產(chǎn)絨量。該研究豐富了山羊基因組數(shù)據(jù)，篩選出了提高產(chǎn)絨量的分子標記，為子午嶺黑山羊羊絨性狀的分子選種提供了科學依據(jù)。