軒慧勇 宋強(qiáng)強(qiáng) 劉雪連 宋超慧 徐琦琦 秦 蕾 夏利寧*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100192)

鼠傷寒沙門(mén)菌是重要的人獸共患腸道致病菌，同時(shí)也是臨床常見(jiàn)的非傷寒沙門(mén)菌致病血清型[1]，對(duì)動(dòng)物和人的感染率和致病力都很高。在抗菌藥物的選擇壓力下，多重耐藥(Multi-drug resistance，MDR)鼠傷寒沙門(mén)菌的檢出率迅速增加并呈全球化擴(kuò)散，在歐美和亞非等世界各地廣泛傳播[2-3]。Kijima等[4]、Porter等[5]和Wang等[6]均報(bào)道鼠傷寒沙門(mén)菌的耐藥率有逐年上升趨勢(shì)，耐藥問(wèn)題已成為公共安全衛(wèi)生領(lǐng)域的核心問(wèn)題之一。耐藥基因的攜帶是耐藥菌株產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，耐藥基因可位于細(xì)菌的染色體上或質(zhì)粒上，在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)通過(guò)水平方式和垂直方式進(jìn)行耐藥基因/質(zhì)粒等的傳遞，造就超級(jí)細(xì)菌[7]，還可以通過(guò)醫(yī)院、養(yǎng)殖場(chǎng)的廢水及動(dòng)物和人的排泄物排放至環(huán)境造成污染，由此帶來(lái)的耐藥問(wèn)題和食品安全問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重。而有關(guān)新疆動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌的耐藥情況鮮見(jiàn)報(bào)道，鼠傷寒沙門(mén)菌在新疆多種動(dòng)物中的分布及基因攜帶情況尚不明確。

本研究以新疆地區(qū)2015—2017年3年內(nèi)分離的寵物源(犬和貓)、雞源、牛源、羊源和豬源鼠傷寒沙門(mén)菌為研究對(duì)象，分離不同動(dòng)物源的鼠傷寒沙門(mén)菌，旨在了解不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌的流行情況、耐藥性以及耐藥基因攜帶情況，對(duì)耐藥株的防控具有重要意義，同時(shí)為深入了解鼠傷寒沙門(mén)菌的多重耐藥機(jī)制提供材料和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)控菌株和試驗(yàn)用沙門(mén)菌

大腸埃希標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌(ATCC25922)購(gòu)自天和微生物試劑有限公司(杭州)；試驗(yàn)用沙門(mén)菌來(lái)源于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室2015—2017年期間分離鑒定并保存的不同動(dòng)物源沙門(mén)菌。菌株背景：2015年烏魯木齊寵物源(犬和貓)沙門(mén)菌39株；2016年伊犁地區(qū)豬源沙門(mén)菌38株、牛源沙門(mén)菌99株和雞源沙門(mén)菌62株；2016年焉耆地區(qū)豬源沙門(mén)菌27株、牛源沙門(mén)菌62株、雞源沙門(mén)菌85株和羊源沙門(mén)菌17株；2017年石河子地區(qū)采集豬源沙門(mén)菌81株。共有不同動(dòng)物源沙門(mén)菌510份，從中鑒定獲得的鼠傷寒沙門(mén)菌用于試驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

氯化鎂孔雀綠增菌液(Rappaport-Vassiliadis Medium，MM)、MH(Mueller-Hinton)培養(yǎng)基、SS瓊脂和沙門(mén)顯色培養(yǎng)基均購(gòu)自?shī)W博星生物技術(shù)有限公司(北京)；甘油和50×TE緩沖液購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；2 000 DNA Maker購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；BstF5I酶購(gòu)自NEB公司；2×Taq PCR Master Mix、瓊脂糖和核酸染料均購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 沙門(mén)菌的復(fù)蘇及模板的制備

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)沙門(mén)顯色培養(yǎng)基分離鑒定后得到的菌株進(jìn)一步通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)攜帶invA基因[8]的沙門(mén)菌進(jìn)行復(fù)蘇，并進(jìn)行模板的制備。方法為：挑取沙門(mén)菌單菌落于1 mL MH肉湯中，37 ℃ 200 rpm過(guò)夜培養(yǎng)，吸取200 μL菌液1 3000 g離心 1 min 棄上清；加500 μL 1×TE緩沖液重懸，13 000 g 離心1 min棄上清；加200 μL 1×TE緩沖液重懸，沸水煮2 min，冰浴2 min；13 000 g離心5 min，取50～60 μL上清即DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 沙門(mén)菌的血清型鑒定

根據(jù)沙門(mén)菌血清型特異性基因進(jìn)行鼠傷寒沙門(mén)菌血清學(xué)鑒定，檢出spy基因的沙門(mén)菌即為鼠傷寒沙門(mén)菌[9]，引物均根據(jù)文獻(xiàn)由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)，相似性>96%判定為該菌株的鑒定結(jié)果。

表1 本研究所用的引物信息

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)發(fā)布的M100-S26抗微生物抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[10]，運(yùn)用瓊脂稀釋法進(jìn)行12種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MICs)的測(cè)定，依照CLSI2017版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。測(cè)試藥物包括臨床常用抗菌藥物以及部分備選抗菌藥物：環(huán)丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)、慶大霉素(GEN)、氨芐西林(AMP)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢曲松(CRO)、亞胺培南(IPM)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FFC)、多粘菌素(CL)、磺胺異惡唑(SMZ)和磷霉素(FOS)。

1.6 耐藥基因檢測(cè)

對(duì)分離鑒定的鼠傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶基因(blaTEM、blaCMY-2和blaSHV)、氟喹諾酮耐藥(Plasmid mediated fluoroquinolone resistant，PMQR)基因(qnrD、qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib)、四環(huán)素類(lèi)耐藥基因(tetA和tetB)、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因(rmtB、aadA2和ant(3″)-Ia)、酰胺醇類(lèi)耐藥基因(floR)、磺胺類(lèi)耐藥基因(sul1)和多肽類(lèi)耐藥基因(mcr-1)的檢測(cè)[11-14]。用BstF5I酶進(jìn)行酶切已檢出aac(6′)-Ib基因的PCR產(chǎn)物，如果存在-cr突變，aac(6′)-Ib基因因失去BstF5I酶的限制性位點(diǎn)不能被切開(kāi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離鑒定

510份不同動(dòng)物源沙門(mén)菌，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)spy基因后得到162株鼠傷寒沙門(mén)菌，分離率為31.8%。圖1為部分spy基因PCR檢測(cè)結(jié)果。不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離率如下：2015年烏魯木齊鼠傷寒沙門(mén)菌的分離率為100.0%(39/39)；2016年伊犁地區(qū)豬源、牛源和雞源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離率依次為0%(0/38)、1.0%(1/99)和1.6%(1/62)；2016年焉耆地區(qū)豬源、牛源、雞源和羊源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離率依次為40.7%(11/27)、48.4%(30/62)、10.6%(9/85)和47.1%(8/17)；2017年石河子豬源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離率為77.8%(63/81)(表2)。

1～9：試驗(yàn)菌株；M：DNA Marker；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照

對(duì)分離結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，寵物源分離率顯著高于其他動(dòng)物源(P<0.05)，羊源和豬源分離率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，雞源分離率最低(表2)。

表2 動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離情況

2.2 動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥及多重耐藥情況

不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)被檢測(cè)的抗菌藥物呈現(xiàn)高耐藥和高敏感結(jié)果(表3)，耐藥率從高到低依次為寵物源，羊源，豬源，牛源和雞源。不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)磺胺異惡唑的耐藥率均為100.0%，對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率超過(guò)80.0%；其中，以寵物源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜最寬，對(duì)被檢測(cè)的12種抗菌藥物中的9種抗菌藥物耐藥，羊源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)其中7種抗菌藥物耐藥，其余動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌都對(duì)其中5種抗菌藥物耐藥；僅寵物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)頭孢曲松和亞胺培南各檢出1株耐藥菌株，對(duì)多粘菌素檢出2株耐藥菌株，其余動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌均對(duì)頭孢曲松、亞胺培南和多粘菌素高度敏感，無(wú)耐藥菌株檢出；除豬源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)慶大霉素檢出3株耐藥菌株外，其余動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)慶大霉素?zé)o耐藥菌株檢出。

表3 動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)12種抗菌藥物的耐藥率

162株動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥在0～9耐有分布，3耐及3耐以上菌株占98.1%(159/162)。不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥均以5耐為主(寵物源5耐占94.8%、牛源5耐占93.6%、羊源5耐占87.4%、雞源5耐占80.0%、豬源5耐占71.5%)(表4)。

表4 動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥率

162株動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌共有12種耐藥譜型，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜型均以5耐譜型CIP-AMP-TET-FFC-SMZ為主，且寵物源(94.8%)、牛源(93.6%)和羊源(87.5%)的5耐譜型菌株數(shù)達(dá)85.0%以上；以豬源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜型最多，共有7種譜型，寵物源鼠傷寒沙門(mén)菌和牛源鼠傷寒沙門(mén)菌各有3種耐藥譜型，而羊源和雞源鼠傷寒沙門(mén)菌各有2種耐藥譜型(表5)。

表5 動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜型

2.3 動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥基因檢測(cè)

不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌均檢出β-內(nèi)酰胺酶基因、四環(huán)素基因、氨基糖苷類(lèi)基因、酰胺醇類(lèi)基因和磺胺類(lèi)基因。除豬源菌以攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因blaCMY-2(93.2%)為主外，其余動(dòng)物源菌以攜帶blaTEM基因?yàn)橹?，blaTEM基因檢出率在60.0%以上；不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌四環(huán)素耐藥基因均以攜帶tetB基因?yàn)橹?，檢出率高達(dá)80.0%以上，僅在豬源鼠傷寒沙門(mén)菌中檢出tetA(5.4%)基因；不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌PMQR因子均以攜帶oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib-cr基因?yàn)橹?，檢出率達(dá)50.0%以上，且aac(6)-Ib基因均存在-cr突變，僅在寵物源菌中檢出qnrS(97.4%)基因。此外，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌氨基糖苷類(lèi)耐藥基因以攜帶aadA2和ant(3″)-Ia為主，檢出率達(dá)60.0%以上，對(duì)酰胺醇類(lèi)耐藥基因floR和磺胺類(lèi)耐藥基因sul1的檢出率也在50.0%以上，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌均未檢出多肽類(lèi)耐藥基因mcr-1(表6)。

4 討 論

沙門(mén)菌是人畜共患病和食物中毒的主要食源性病原菌之一，除在自然界中分布極廣外，雞、鴨、豬、牛、羊等家禽和家畜動(dòng)物腸道也廣泛分布，給養(yǎng)殖業(yè)和食品安全造成潛在危害[15]。鼠傷寒沙門(mén)菌是食源性沙門(mén)菌的優(yōu)勢(shì)血清型，如廣西、河北、河南和廣東等都有報(bào)道[16]。本研究分離結(jié)果顯示，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌的整體分離率為31.8%，其中，以寵物源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離率最高，達(dá)100.0%，羊源和豬源鼠傷寒沙門(mén)菌的分離率也達(dá)到47.0%以上。本研究從不同動(dòng)物源中均分離出鼠傷寒沙門(mén)菌，說(shuō)明鼠傷寒沙門(mén)菌在自然界中宿主廣泛，若從蛋肉產(chǎn)品中檢出耐藥鼠傷寒沙門(mén)菌，則會(huì)存在食品安全隱患。此外，耐藥鼠傷寒沙門(mén)菌可在人和動(dòng)物之間通過(guò)食物鏈甚至是與寵物親密接觸時(shí)進(jìn)行傳遞，為保障公共衛(wèi)生安全，應(yīng)加強(qiáng)耐藥鼠傷寒沙門(mén)菌的監(jiān)測(cè)。

本研究對(duì)新疆地區(qū)不同動(dòng)物源分離的鼠傷寒沙門(mén)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，新疆地區(qū)鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重，以寵物源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥譜最寬，對(duì)被檢測(cè)的9種抗菌藥物耐藥，但對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松和亞胺培南均檢出1株耐藥株，可能是寵物主人擅自對(duì)寵物使用人用藥物或不按療程給寵物用藥造成的。不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)被檢測(cè)的抗菌藥物磺胺異惡唑的耐藥率高達(dá)100.0%，與張?jiān)龇錥17]報(bào)道的上海市零售肉中和環(huán)境中鼠傷寒沙門(mén)菌的耐藥結(jié)果一致，但耐藥率高于夏宇飛等[18]報(bào)道的湖南地區(qū)豬源及雞源對(duì)磺胺異惡唑的耐藥率(60.0%～70.0%)，藥敏結(jié)果顯示出不同地區(qū)以及不同動(dòng)物源由于使用抗菌藥物的種類(lèi)和劑量的差異，其耐藥結(jié)果也相差較大[17-18]。此外，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率高達(dá)80.0%以上，耐藥率與羅學(xué)輝等[19]報(bào)道的河水、食品及食源性疾病患者中鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥結(jié)果一致，分析原因可能是以上幾種藥物性價(jià)比高，容易獲得，長(zhǎng)期不合理的使用甚至濫用，導(dǎo)致高水平耐藥菌株的出現(xiàn)。鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)慶大霉素、頭孢噻呋、頭孢曲松和多粘菌素的耐藥率處于較低的水平，耐藥率在2.6%～5.1%，可作為治療細(xì)菌性疾病的備選藥物，但由于鼠傷寒沙門(mén)菌要較其他血清型的沙門(mén)菌更易產(chǎn)生耐藥性[15]，因此在治療時(shí)要注意藥物的使用頻率和劑量，降低耐藥菌的產(chǎn)生率。

多重耐藥結(jié)果顯示，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥率達(dá)98.0%以上，與段瑤等[20]報(bào)道的畜禽鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥率(90.44%)基本一致，本研究中以5耐菌株占比最高，達(dá)77.8%，8耐及以上耐藥菌株占比達(dá)10.4%，多重耐藥結(jié)果顯示出新疆不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)臨床使用的很多抗菌藥物已普遍產(chǎn)生耐藥性，不僅耐藥率高，并且對(duì)抗菌藥物的交叉耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，進(jìn)而增加多重耐藥菌的感染率。不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌共有12種耐藥譜型，以豬源耐藥譜型最多，有7種耐藥譜型，分析原因是相對(duì)于其他動(dòng)物，豬養(yǎng)殖基本趨于規(guī)?；?，養(yǎng)殖過(guò)程中豬只更易感染細(xì)菌性疾病。此外，養(yǎng)殖場(chǎng)為了避免豬只患病，也可能會(huì)飼喂含有抗菌藥物的飼料，故而豬只使用抗菌藥物的頻率和種類(lèi)較其他動(dòng)物多，因此豬源鼠傷寒沙門(mén)菌具有較寬的耐藥譜型。本研究中不同動(dòng)物源多重耐藥優(yōu)勢(shì)表型為CIP-AMP-TET-FFC-SMZ，耐藥譜寬，多重耐藥嚴(yán)重。四環(huán)素、氟苯尼考和磺胺異惡唑都是長(zhǎng)期使用在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中的藥物，該耐藥譜型的形成與這些抗菌藥物的使用密切相關(guān)。此外，鼠傷寒沙門(mén)菌在用藥的環(huán)境中，部分菌株通過(guò)染色體的局部抑制基因突變，抑制孔蛋白表達(dá)，進(jìn)而使抗菌藥物無(wú)法進(jìn)入菌體內(nèi)，也是沙門(mén)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生耐藥性的原因[21]。

細(xì)菌攜帶耐藥基因是其耐藥性產(chǎn)生和傳播的主要原因之一。本研究對(duì)七大類(lèi)16種耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌除對(duì)多肽類(lèi)耐藥基因未檢出外，對(duì)其他六類(lèi)被檢測(cè)的抗菌藥物的耐藥基因均有檢出，除豬源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)blaTEM和tetA基因的檢出率為6.8%和5.4%以外，不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)其余檢出的耐藥基因的檢出率高達(dá)50.0%以上，本研究耐藥結(jié)果顯示出新疆不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥基因攜帶率很高。值得注意的是，鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥主要是由于產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，并以blaTEM型、blaCTX-M型、blaOXA型和blaSHV型較為常見(jiàn)[21]，本研究結(jié)果顯示，寵物源、羊源和雞源鼠傷寒沙門(mén)菌均以攜帶blaTEM型為主，該耐藥基因的檢出率在62.5%以上，但豬源鼠傷寒沙門(mén)菌卻以攜帶blaCMY-2型為主，雖然都是介導(dǎo)對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥，但不同動(dòng)物源主要攜帶的耐藥基因卻不同。此外，blaTEM基因可以在不同菌株間進(jìn)行水平傳播和垂直傳播，而攜帶blaTEM基因的陽(yáng)性菌株通常都帶有多重耐藥，給多重耐藥菌的防控造成巨大壓力[22]。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)耐藥表型與耐藥基因型不完全正相關(guān)，如羊源鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)酰胺醇類(lèi)和磺胺類(lèi)的耐藥率高達(dá)100.0%，但相關(guān)耐藥基因floR和sul1的檢出率為50.0%～62.5%。耐藥基因的位置、表達(dá)情況及不同耐藥基因之間的相互作用會(huì)影響細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。新疆地廣人稀，故監(jiān)測(cè)范圍有限，且樣本數(shù)量和樣本收集年限有限，不能十分全面反映出新疆近年來(lái)不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌的耐藥情況。應(yīng)在全疆范圍內(nèi)加大對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌菌株的監(jiān)測(cè)，進(jìn)而提供更全面的結(jié)果。

綜上，新疆不同動(dòng)物源耐藥鼠傷寒沙門(mén)菌分布廣泛，對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素、氟苯尼考和磺胺異惡唑等常用抗菌藥物高度耐藥，可根據(jù)藥敏結(jié)果選用頭孢噻呋和慶大霉素等敏感性較高的抗菌藥物來(lái)提高療效。不同動(dòng)物源鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥嚴(yán)重，具有相同耐藥譜型，且耐藥基因攜帶率高，存在克隆傳播的風(fēng)險(xiǎn)。為更全面掌握新疆動(dòng)物源性鼠傷寒沙門(mén)菌的耐藥情況，應(yīng)對(duì)鼠傷寒耐藥沙門(mén)菌進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室和流行病相結(jié)合的監(jiān)測(cè)模式，進(jìn)而更好的保護(hù)動(dòng)物和人類(lèi)健康。