顧佳麗*， 王思宇， 楊 丹， 黃曦瑤， 何 茜， 秦洪偉

(渤海大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧錦州 121013)

苯并咪唑(BMZs)是一種合成的抗寄生蟲藥物，由于其高效性和廣譜性，在農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛用于治療吸蟲和線蟲感染[1]。但是不正確的使用會使BMZs在食用動植物產(chǎn)品中殘留，并通過食物鏈在人體中累積，對人體健康構(gòu)成潛在的危害[2]。動物實驗證明，某些BMZs具有致畸和致突變的作用[3]，因此，BMZs被中國、美國和歐盟等多個國家和地區(qū)列為獸藥殘留的重要監(jiān)控對象[4]，并制定了最大殘留限量[5]。

BMZs對人體的毒性與血清白蛋白(SA)的儲運功能密切相關(guān)[6]。SA作為人和動物血漿中重要的載體蛋白，可以與多種外源性物質(zhì)結(jié)合，影響其在生物體中的儲存、分布、代謝和毒性[7]。本文以BMZs中常用藥物甲苯達唑(MBZ)為例，研究MBZ與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用機制，對于從分子水平上了解BMZs藥物在生物體內(nèi)的分布、吸收及潛在毒性具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

Fluoromax-4NIR型熒光分光光度計(法國，堀場)；FLS1000型穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀(英國，愛丁堡)；Jasco J-810型圓二色光譜儀(日本，分光)；UV2800型紫外-可見分光光度計(上海舜宇恒平)；傅里葉變換紅外光譜儀(德國，布魯克)。

牛血清白蛋白(BSA，Sigma)；甲苯達唑(MBZ)、華法林鈉、布洛芬和8-苯胺-1-萘磺酸(阿拉丁)；乙腈(國藥試劑)。BSA儲備液(1.0×10-4mol·L-1)用pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制，冷藏保存，現(xiàn)用現(xiàn)配；MBZ儲備液(1.0×10-4mol·L-1)用乙腈溶解配制，避光保存；華法林鈉與布洛芬儲備液用乙醇配制。其它試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.2 時間分辨熒光光譜的測定室溫下測定了BSA及其與MBZ作用的熒光壽命，激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長345 nm，量子點數(shù)收集5 000，采用儀器自帶軟件進行熒光壽命擬合。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)的測定于比色管中加1.0×10-6mol·L-1的BSA溶液3.0 mL，滴加MBZ溶液(1.0×10-4mol·L-1)，分別測定BSA及其與MBZ作用的紫外-可見吸收光譜。

1.2.4 圓二色光譜(CD)的測定波長范圍200～250 nm，掃描速度100 nm·min-1，樣品池光徑1 mm，分辨率0.1 nm，分別測定BSA及其與MBZ作用的CD光譜。

1.2.5 傅里葉紅外(FT-IR)光譜的測定采用衰減全反射法(ATR)記錄了BSA及其與MBZ作用的FT-IR光譜，分辨率為4 cm-1，掃描分辨率為128。分別收集BSA溶液和緩沖溶液的光譜，并做差譜得到作用前的BSA的紅外光譜，同樣條件下掃描MBZ-BSA體系和MBZ的紅外光譜，做差譜得到與MBZ作用后的BSA紅外光譜。

1.2.6 8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)熒光光譜的測定固定ANS與BSA的濃度比為5∶1，滴加MBZ溶液，激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長400～600 nm，其它條件同熒光光譜法。

1.2.7 共振散射熒光光譜(RLS)的測定波長測定范圍250～600 nm，Δλ=0 nm時同步掃描BSA及其與MBZ作用的RLS光譜。其它參數(shù)設(shè)定同熒光光譜測定。

1.2.8 位點競爭實驗固定BSA與MBZ的濃度比為1∶5，變化華法林或布洛芬的濃度從5.0×10-7～2.5×10-6mol·L-1，測定熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 MBZ與BSA相互作用的熒光光譜

圖1 BSA與MBZ作用的熒光光譜Fig.1 Fluorescence of spectra of BSA and MBZ cBSA=1.0×10-6 mol·L-1,cMBZ=0,2,4,6,8,10,12(×10-6 mol·L-1).

BSA與MBZ作用的熒光光譜見圖1。BSA在波長347 nm處有較強吸收峰，隨著MBZ濃度的增大，BSA的熒光強度降低且藍(lán)移至344 nm。這表明MBZ會猝滅BSA的熒光強度，并影響氨基酸周圍微環(huán)境，疏水性增加[9]。

2.2 熒光猝滅機制

熒光猝滅機制主要有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。猝滅過程符合Stern-Volmer方程[10]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q])。以F0/F對[Q]作圖，由曲線斜率求出MBZ對BSA的猝滅常數(shù)KSV見表1。KSV隨溫度的升高而減小，且三個溫度下Kq均大于猝滅劑對蛋白質(zhì)的最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，因此推斷MBZ對BSA的猝滅主要為靜態(tài)猝滅。

表1 BSA與MBZ作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及熱力學(xué)常數(shù)Table 1 Quenching constants,binding constants and thermodynamics parameters of BSA and MBZ

2.3 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)

MBZ與BSA形成復(fù)合物，可用雙倒數(shù)方程：(log[(F0-F)/F]=logKA+nlog[Q])[11]，以log[(F0-F)/F]對log[Q]作圖，由曲線的截距和斜率計算MBZ與BSA作用的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點數(shù)n(表1)。KA均約為104L·mol-1，說明MBZ和BSA形成了較為穩(wěn)定的復(fù)合物，BSA可以攜帶轉(zhuǎn)運MBZ。n約為1，表明MBZ與BSA之間存在一個結(jié)合位點。

2.4 熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型

2.5 能量轉(zhuǎn)移與結(jié)合距離的計算

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[13]，當(dāng)供體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜之間有充分的重疊，且作用距離小于7 nm時，它們之間很可能發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。由MBZ的吸收光譜和BSA的發(fā)射光譜重疊求得積分J=2.8×10-15cm3·L·mol-1，臨界距離R0=1.98 nm，能量轉(zhuǎn)移效率E=18.4%，作用距離r=3.84 nm，說明MBZ和BSA之間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移的可能性極高。r>R0，說明MBZ對BSA熒光猝滅主要是由靜態(tài)猝滅引起的。

2.6 時間分辨熒光光譜

對于動態(tài)猝滅，猝滅劑會縮短熒光分子激發(fā)態(tài)壽命，而對于靜態(tài)猝滅，熒光分子激發(fā)態(tài)壽命則不會發(fā)生改變。將BSA與MBZ作用前后的熒光衰減曲線進行雙指數(shù)擬合，并根據(jù)方程：〈τ〉=(B1τ1+B2τ2)/(B1+B2)[14]計算BSA的熒光壽命為τ1=4.75 ns(38.65%)，τ2=6.75 ns(61.35%)，平均壽命5.98 ns(χ2=1.16)。與MBZ作用后，BSA的熒光壽命變?yōu)棣?=4.26 ns(52.95%)，τ2=7.12 ns(47.05%)，平均壽命5.61 ns(χ2=1.13)。MBZ沒有引起B(yǎng)SA熒光壽命的明顯改變，因此推斷MBZ對BSA的猝滅主要為靜態(tài)猝滅。

2.7 MBZ對BSA構(gòu)象的影響

圖2 BSA與MBZ相互作用的紫外-可見光譜Fig.2 UV-Vis absorbance spectra of BSA and MBZ cBSA=1.0×10-6 mol·L-1,cMBZ=0,3,6,9,11.9,14.8,17.7(×10-6 mol·L-1).

2.7.1 紫外-可見吸收光譜圖2為BSA與MBZ作用的吸收光譜，BSA分別在波長208 nm和278 nm處有兩個吸收峰，208 nm處的較強吸收峰與BSA分子中肽鏈構(gòu)象有關(guān)，278 nm處的較弱吸收峰與芳香氨基酸周圍微環(huán)境的極性有關(guān)。隨著MBZ濃度的增大，BSA在208 nm處的吸光度減小且紅移至210 nm，278 nm處的吸收峰減小且略紅移(1 nm)，這說明MBZ誘導(dǎo)BSA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且影響氨基酸殘基周圍微環(huán)境的極性減小[15]。

2.7.2 同步熒光光譜同步熒光光譜可以提供發(fā)色團周圍微環(huán)境的特征信息。當(dāng)Δλ=15 nm或Δλ=60 nm時，BSA的同步熒光光譜只顯示酪氨酸或色氨酸的熒光光譜特征。由圖3(A)可以看出，當(dāng)Δλ=15 nm時，同步熒光光譜變化較?。欢鴪D3(B)表明，當(dāng)Δλ=60 nm時，隨著MBZ濃度的增加熒光強度減小且略有藍(lán)移(349～347 nm)。說明MBZ主要猝滅的是色氨酸殘基，并使其周圍疏水性增加[16]。

圖3 BSA與MBZ作用的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of BSA with MBZ cBSA=1.0×10-6 mol·L-1,cMBZ=0,2,4,6,8,10,12(×10-6 mol·L-1).

圖4 BSA與MBZ相互作用的CD光譜Fig.4 CD spectra of BSA and MBZ cBSA=1.5×10-6 mol·L-1,cMBZ/CBSA=0∶1,10∶1,20∶1.

2.7.4 傅里葉變換紅外光譜紅外光譜法是研究BSA二級結(jié)構(gòu)變化的常用方法。BSA的紅外光譜主要分為位于1 700～1 600 cm-1的酰胺Ⅰ帶(C=O的伸縮振動吸收)，以及位于1 600～1 500 cm-1的酰胺Ⅱ 帶(C-N伸縮振動與N-H面內(nèi)彎曲振動)[18]。酰胺Ⅰ帶對BSA的二次結(jié)構(gòu)變化比酰胺Ⅱ帶更敏感。利用傅里葉去卷積和二階導(dǎo)數(shù)技術(shù)處理紅外光譜，將酰胺Ⅰ帶分解為多個子峰，并估算子峰的位置和寬度(圖5)。通過曲線擬合，定量分析BSA二級結(jié)構(gòu)各組分的含量為：反平行β-折疊(1 680～1 690 cm-1)11.0%；β-轉(zhuǎn)角(1 680～1 660 cm-1)14.1%；α-螺旋(1 660～1 649 cm-1)53.2%；無規(guī)則卷曲(1 638～1 648 cm-1)13.5%；β-折疊(1 615～1 637 cm-1)8.2%。與MBZ作用后，BSA的反平行β-折疊含量增加到13.6%，β-轉(zhuǎn)角含量增加到15.4%，α-螺旋含量減少到43.8%；無規(guī)則卷曲含量增加到17.7%，β-折疊增加到9.5%。這一結(jié)果說明MBZ使BSA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這一結(jié)果與圓二色光譜是一致的。

圖5 BSA(A)與MBZ作用(B)的紅外(IR)光譜Fig.5 IR spectra of BSA(A) and MBZ(B)

2.7.5 ANS熒光光譜ANS是一種對于疏水性環(huán)境敏感的熒光探針，常用于研究蛋白質(zhì)表面疏水性變化。BSA-ANS體系與MBZ作用的熒光光譜如圖6所示。ANS在水中的熒光強度很弱，但與BSA的疏水性基團結(jié)合后熒光強度顯著增強。隨著MBZ濃度的增大，BSA-ANS體系的熒光強度降低，這說明MBZ使BSA表面疏水性減少[19]。

2.8 共振散射光譜

BSA與不同濃度MBZ作用的共振散射光譜見圖7所示。BSA的共振散射信號較弱，但隨著MBZ濃度的增大，體系的共振散射強度顯著增強，其原因可能是MBZ與BSA形成粒徑較大的復(fù)合物，導(dǎo)致共振散射信號增強[20]。

圖6 MBZ對BSA-ANS體系的熒光猝滅光譜Fig.6 Fluorescence quenching spectra of BSA-ANS by MBZ a:BSA,cBSA=1.0×10-6 mol·L-1.b:ANS,cANS=1.0×10-5 mol·L-1,cMBZ(c-i)=0,2,4,6,8,10,12(×10-6 mol·L-1).

圖7 MBZ與BSA作用的共振散射光譜Fig.7 RLS of MBZ and BSA cBSA=1.0×10-6 mol·L-1；cMBZ(a→e)=0,4.5,5.7,8.0,9.1(×10-6 mol·L-1).

2.9 結(jié)合位點

BSA通常有兩個結(jié)合位點和藥物發(fā)生結(jié)合，一是位于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA的色氨酸殘基Trp212；二是位于亞結(jié)構(gòu)域ⅢA的色氨酸殘基Trp314，分別定義為Site Ⅰ和Site Ⅱ。華法林(Site Ⅰ)和布洛芬(Site Ⅱ)是最常用的位點探針。位點探針的百分?jǐn)?shù)可用公式(Probe Displacement(%)=F2/F1×100%)計算[21]。結(jié)果表明，華法林使得MBZ-BSA體系的Probe Displacement(%)由92.0%下降至61.5%，布洛芬使得MBZ-BSA體系的Probe Displacement(%)由95.2%下降至94.0%。這說明MBZ和華法林在Site Ⅰ發(fā)生了競爭，即MBZ結(jié)合在BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅡA處的Site Ⅰ。

3 結(jié)論

本文通過多種光譜法研究了MBZ與BSA的相互作用機制。實驗結(jié)果表明，MBZ會與BSA通過范德華力和氫鍵形成復(fù)合物，從而導(dǎo)致BSA熒光猝滅。UV-Vis光譜、同步熒光光譜、FTIR光譜和CD光譜實驗結(jié)果表明，MBZ誘導(dǎo)BSA二級結(jié)構(gòu)改變，并且影響色氨酸周圍微環(huán)境。位點競爭實驗表明，MBZ結(jié)合在BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅡA處的SiteⅠ。實驗結(jié)果以期為從分子水平上了解苯并咪唑類藥物與蛋白質(zhì)的作用機制提供參考依據(jù)。